生长期施用GA4+7对黄冠梨贮藏过程中挥发性有机化合物的变化影响

郑欣欣,颜朦朦,陈子雷,杜红霞,杨亲正,张文君*

1.齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,山东 济南 250353;2.山东省农业科学院 农产品质量标准与检测技术研究所,山东 济南 250100

植物生长调节剂(plant growth regulators,PGRs)是植物中天然存在(植物激素)或合成开发的一类有机物质,对植物的生长发育有促进、延缓或抑制作用[1-2]。目前已发现并公认的植物调节剂有脱落酸、赤霉素、乙烯、生长素、茉莉酸甲酯、芸苔素内酯等[3-4]。PGRs制造成本低廉、用量少、见效快,已在多种作物的生产中得到了广泛应用[5-8]。其中,在梨果中的应用发现,吲哚乙酸氧化产物能促进Barlett梨的成熟[9]、喷洒2.0×10-5的赤霉素(GA3)溶液可以提高软梨品种的坐果率[10]。植物生长调节剂不仅影响水果重量,还能调节水果的香气组分。CHEN等[11]在甜瓜花的子房上喷洒膨胀剂溶液(氯吡苯脲,2.5×10-6),发现氯吡苯脲(CPPU)处理的果实中可代谢为香气物质的氨基酸含量显著高于蜜蜂授粉的果实,表明氯吡苯脲的施用影响了香气的产生。王建萍等[12]用低浓度的GA3+CPPU搭配壳聚糖、海藻精施用,显著提高了“阳光玫瑰”的果实香气且挥发性有机化合物的种类增多。

香气是水果最重要的感官属性之一,由几百甚至上千种化合物组成,主要包括酯类、醇类、醛类、萜烯等,不同种类与不同含量的香气物质共同形成了不同果品的独特香气[13]。香气同时也是采收期和贮藏期判断的重要指标之一[14-15]。然而研究发现,果品长期冷藏后,香气会明显减弱[16]。目前,很多专家研究梨果采后植物生长调节剂的施用,发现部分植调剂对于梨贮藏期香气成分的保持或改善有明显的作用。例如,LUO等[17]将采摘后的南果梨用浓度为2 mmol·L-1的水杨酸浸泡15 min后再进行长时间低温贮藏,发现水杨酸处理可以增加长期冷藏黄冠梨中酯类芳香物质的含量。YIN等[18]用浓度为0.1 mmol·L-1的茉莉酸甲酯水溶液给采摘后的南果梨进行喷雾,南果梨风干后进行冷藏,发现茉莉酸甲酯可以通过调节乙烯生成和信号转导途径来减少冷藏后南果梨12 d货架期内香气酯的损失。

梨果在生长过程中使用植物生长调节剂是否对果品贮藏过程中挥发性物质形成有影响,目前还未可知。因此,在本文中,我们采用HS-SPME结合GC×GC/TOFMS方法对生长期施用GA4+7植物生长调节的黄冠梨进行研究,分别从挥发性物质的种类、质量分数和数量、香气特征质量分数百分比分布等方面进行了综合分析和评价,最终掌握采集样品贮藏过程中挥发性物质的变化规律。本研究将详细提供生长期施用GA4+7后,黄冠梨果样品香气品质的变化,不仅为其贮藏时期的确定提供数据支撑,同时可为梨果生产过程中植调剂的施用规程提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

黄冠梨果样品分为两组处理,为梨果对照组(CK),GA4+7处理组。

2-壬酮(99.0%),德国Dr.Ehrensorfer公司;甲醇(HPLC级),美国Fisher公司;GA4+7,石家庄开发区一生化科技有限公司;市面常见长杆喷雾器;50/30 μm DVB/CAR/PDMS(divinylben-zenelcarboxen/polydimethylsiloxane,二乙烯苯/羧乙基/聚二甲基硅烷)萃取头,美国SUPELCO公司;DB-5MS(30 m×250 μm,0.25 μm)色谱柱、Rxi-17sil MS柱(2 m×250 μm,0.25 μm),美国安捷伦公司;Sartorius BSA224S-cW分析天平,德国赛多利斯公司;SUPELCO固相微萃取装置,美国色谱科公司;CORNING PC-420 D磁力搅拌器,美国康宁公司;Agilent 7890B气相色谱仪(配备LECO Pegasus 4D TOFMS质谱仪),美国安捷伦公司。

1.2 方法

1.2.1 田间试验及采后处理

于2020年山东聊城一商业果园内,对盛花后30 d、疏果后套袋前的全棵果树进行植物生长调节剂的均匀喷施,每一处理重复3次,每组处理选择果树5～6棵。空白对照按照同样的方法喷施清水。梨果在八月中下旬的商业成熟期采摘,当天运回山东省农业科学院,储藏在0～4 ℃的冷库内200 d,每隔50 d取样测试,每次测试重复3次。

1.2.2 内标溶液的制备

精准称取0.1 g(精确至0.000 1 g)2-壬酮标准品,用甲醇溶液稀释至10 mg/L备用,所有标准溶液于-18 ℃冰箱中贮存。

1.2.3 全二维气相色谱/质谱条件

挥发性组分在全二维气相色谱/飞行时间质谱仪上进行分析。色谱条件:色谱柱以1.4 mL/min恒定流速的高纯氦气使用。前进样口和传输线温度分别设置为270 ℃和280 ℃。色谱一维烘箱温度程序:起始温度为40 ℃持续2 min,然后以5 ℃/min上升至200 ℃,最后以20 ℃/min上升至280 ℃并保持2 min。二维烘箱温度在色谱运行的整个过程中始终比一维烘箱高5 ℃,调制器温度比二维烘箱高15 ℃。调制周期为3 s,热脉冲时间为0.6 s。

质谱条件:质谱仪在-70 V的电子电离(EI)模式下进行,采集范围为33～550 m/z,采集速率为100(spectrum/s)。离子源温度设置为250 ℃,采集延迟60 s。检测器电压为1 450 V。全氟三丁胺(PFTBA)用于日常校准和调整。

1.2.4 梨挥发性成分的提取

根据前人文献中所用方法进行挥发性物质的提取[19-23]。采用四分法将梨果分为四部分,去除每个梨的果核和种子,果实切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的立方体。将6.00 g样品放入15 mL螺旋帽小瓶中,密封小瓶之前,加入5 μL 10 mg/L的2-壬酮作为内标,静置10 min,之后将萃取头暴露在小瓶顶部空间40 min以吸附挥发性成分,萃取温度保持在40 ℃。最后,在色谱柱10∶1的分流模式条件下将萃取头立即插入270 ℃的GC进样口解析2 min。

1.3 数据处理方法

1.3.1 挥发性化合物半定量质量浓度的测定

采用计算机进行仪器控制、数据采集和处理并将各组分与NIST2017谱库进行比较,最小相似度值为700。挥发性化合物的含量通过其峰面积与内标物(2-壬酮)的峰面积进行比较来计算。半定量质量浓度计算公式如下[19]:

Ca:挥发性物质的质量分数(ng/g);Sa:挥发性物质的峰面积;Sis:内标物的峰面积;Cis:内标物的质量浓度(μg/mL);m:样品质量(g);2-壬酮的质量浓度为10 μg/mL;样品的质量为6.00 g。

1.3.2 挥发性有机化合物保留指数的测定

保留指数(IR)又称科瓦茨(kovats)指数,是使用最广泛并被国际上公认的定性分析法,为色谱定性分析的一个重要参数。在本研究中,通过根据步骤1.2.4的分析获得了正构烷烃(C6-C9、C8-C40)的保留时间,并计算了各挥发性化合物的保留指数,旨在辅助TOF-MS与NIST谱库相匹配为化合物定性的可靠性。ChromaTOF GC使用邓肯工具和Kratz方程计算保留指数。公式为[19]:

TRa:目标化合物的保留指数;a:目标化合物;n:低级正构烷烃的碳数;N:高级正构烷烃的碳数;TR:保留时间。

1.3.3 特征香韵的分析

1.4 统计分析

应用SIMCA-P 14.1软件进行主成分分析(PCA),以检测聚类形成并建立样品与挥发性有机化合物之间的关系。应用SPSS19.0统计软件进行所有统计分析,计算了单向方差并通过邓肯检验检测单向方差差异的显著性(P<0.05)。数据显示为平均值±标准差(n=3)。

2 结果与讨论

2.1 贮藏期间黄冠梨中的挥发性物质鉴定

我们对生长期间施用了GA4+7的黄冠梨在0～200 d贮藏过程中的8类挥发性化合物(酯类、烯类、醇类、醛类、酮类、烷烃类、芳烃类和硫化物类)进行了检测,总离子流图见图1。在贮藏当天,GA4+7处理组中的总挥发性物质质量分数最高,达到了636 ng/g,化合物数量在3个组当中也最高(53种),见图2(a)和图3(b)。但随着贮藏时间的延长,到贮藏时间结束时,对照和GA4+7处理组中的挥发性物质质量分数全部下降严重(下降了587～292 ng/g)。

图1 黄冠梨的GC×GC/TOFMS总离子流图

从图2(b)～(c)可知,通过不同类型香气物质的相对质量分数比对发现酯类是“黄冠梨”中最主要的挥发性有机化合物且在贮藏过程中的变化较明显。在贮藏当天,相比于对照(72.2%),GA4+7处理组(85.0%)中酯类物质质量分数占比较高;但随着贮藏时间的延长,在200 d贮藏期结束时,对照和GA4+7处理组的酯类质量分数分别下降了221 ng/g和514 ng/g,质量分数占比也分别下降了12.4%和30.1%。并且,从图3可看出,贮藏当天(第0 d)到贮藏结束(第200 d),酯类物质的数量在对照和GA4+7处理组中的变化也有很大差别。对照中的酯类物质数量先上升后下降,最后与贮藏当天的种类数量保持在相同水平;而GA4+7处理组中的酯类数量持续下降(从33种减少到了23种)。这个结果表明被GA4+7处理过的梨果具有高的成熟度以及差的耐贮性[26-27]。

除酯类物质外,醇类和醛类挥发性物质也是梨果香气组成的重要部分,在梨果成熟的过程中开始积累[28]。通过对醛类和醇类进行分析,发现在采摘的当天,醇类与醛类这两种物质在对照(36.9 ng/g;56.7 ng/g)与GA4+7处理组中(26.2 ng/g;53.5 ng/g)的质量分数差别不大;随着贮藏时间的延长,对照和GA4+7处理组中的醇类物质的质量分数分别下降了25.3 ng/g和14.5 ng/g(质量分数占比分别上升了5.04%,20.0%),醛类分别下降了52.9 ng/g和50.8 ng/g(质量分数占比下降了10.5%,2.64%)。

除上述描述的化合物之外,烯类化合物也是一种梨果中常见的挥发性化合物,之前在西洋梨、亚洲梨中均有检出[25,29-30]。本研究中,在贮藏当天和贮藏结束的各个处理组中出现了多种挥发性烯类化合物,如主要靠碳水化合物分解产生的α-法尼烯,(Z,E)-α-法尼烯等[25,31]。由表1、表2和图3可看出,到贮藏结束时,对照中烯类化合物的质量分数上升了2.19 ng/g,其数量增加了2种,质量分数占比上升了5.22%;而GA4+7处理组中的烯类化合物质量分数下降了5.65 ng/g,其数量也减少了2种,质量分数占比上升了5.44%。此结果再次表明,与对照相比,GA4+7处理过的梨果在低温贮藏过程中的挥发性物质质量分数极易下降。

基于以上发现,GA4+7处理过的梨果具有较高的成熟度,但耐贮性较差,挥发物容易在贮藏期分解或挥发。

表1 对照组梨果中烯烃类挥发性物质的质量分数 单位:ng/g

表2 赤霉素4+7组梨果中烯烃类挥发性物质的质量分数 单位:ng/g

注:(a)对照组和处理组在0～4℃下贮藏0～200 d中总挥发性物质质量分数变化;(b,c)对照组和处理组在0～4 ℃下贮藏0～200 d中各类别挥发性成分相对质量分数占比变化。

图3 对照组(a)和处理组(b)在0～4 ℃下贮藏0～200 d中的挥发性物质种类数量变化

2.2 黄冠梨贮藏过程中的挥发性有机化合物变化趋势

我们对各个处理组0～200 d贮藏期内黄冠梨中检测出的各种挥发性有机化合物进行主成分分析(principal component analysis,PCA)。如图4所示,PC1和PC2两个分量共解释了75%以上的方差。随着贮藏时间的延长,样品在PCA载荷图的不同区域分布明显,说明贮藏期的变化对香气组分有显著影响。

除此之外,储存对不同处理组中同一类挥发性化合物的影响也不同。为了更加清晰地了解主要成分的变化,我们进行了热图分析。如图5所示,由热图清晰地展示了各处理组中的化合物随贮藏时间的质量分数变化,由图可看出不同贮藏阶段下各处理组中的优势化合物。从整个贮藏期来看,在对照组贮藏初期,乙醛、己醇、乙醇、3-己酮和2-己酮等非酯类物质的质量分数较高,随着贮藏时间的延长,开始出现质量分数较高的(E)-2-己烯酸甲酯、乙酸异戊酯等酯类物质,到贮藏结束时,出现了烯类物质如:1-十四烯、(Z)-3-十四碳烯等。可见贮藏对梨果中化合物的种类和质量分数有较大影响。GA4+7处理组与对照在贮藏初期的高质量分数化合物种类不同,在GA4+7处理组中,丁酸己酯、惕各酸乙酯、乙酸异丁酯等数量较多的酯类化合物占很大优势,随着贮藏的进行,开始出现丁醇和α-蒎烯等醇类和烯类化合物,到贮藏结束时2-癸烯-1-醇、十二烷、壬醛等化合物出现。

鉴于以上,我们推测,对照组在贮藏初期还未达到最高的成熟度,这一阶段的物质代谢主要是氢过氧化物在HPL酶的作用下生成醇和醛等非酯类物质;经过贮藏,梨果成熟度逐渐升高,醛类物质在ADH酶的作用下代谢为醇类物质,而醇类物质在AAT酶的作用下与乙酰辅酶A一起合成酯类物质;有趣的是,在酯类物质形成的过程中会产生丙酮酸和乙酰辅酶A为主的代谢物质,而这两种物质恰恰是通过MVA途径和MEP途径合成萜烯类物质的底物,这也就导致了在贮藏的后期烯类物质开始出现。而施用GA4+7激素后,梨果在贮藏初期的酯类化合物质量分数明显增多但随着贮藏时间的延长其质量分数会严重减少。据此我们推测GA4+7提高了脂氧合酶、HPL酶、ADH酶等的活性,合成酯类、醇类等物质的速度较快,所以在采摘时其挥发性物质质量分数较对照高出很多,相应的促进了梨果的成熟度。然而在贮藏过程中梨果中合成酯类香气物质的酶类物质活性不断降低,且酯类物质一部分挥发,一部分在梨果中被相关酶类分解,生成其它类的挥发性物质,如烯类及几种醇。由此可见GA4+7激素对于梨果香气物质的形成与转化有显著的影响[25-27,32-33]。这说明生长施用植调剂后对梨果贮藏过程中的香气物质的变化也有显著影响。

图4 对照组(a)和处理组(b)在0～4 ℃下贮藏0～200 d中的挥发性物质主成分分析

图5 对照组(a)和处理组(b)在0～4 ℃下贮藏0～200 d中的挥发性物质热图分析

2.3 黄冠梨贮藏过程中的特征香气占比变化

水果香气由各种挥发性有机化合物组成,只有把这些芳香性有机物质作为一个整体时,才构成果实的整体香气特征。为了探索黄冠梨在贮藏过程中的整体香气特征的变化,我们在“气味ABC”系统和检出的香气成分的基础上对各个处理组中的特征香韵值进行了计算。相对影响值表示一种香气成分与芳樟醇相比的强度,芳樟醇的固定值为100。ABC值代表26种气味分类中一种香气成分的百分比,26种气味类别见图6,数据显示在表3中。

如图6所示,在0～200 d的贮藏期内,梨果中共检测出18种香型,这些香型中以酯香(A)、果香(F)与青草香(G)的质量分数最高,是梨果中的主要特征香型。所有香型中质量分数最高的果香,在对照和GA4+7处理组中的差别也最明显。与对照(60.0%)中的果香质量分数相比,GA4+7处理组在贮藏当天的果香质量分数(75.6%)是最高的。然而随着贮藏时间的延长,GA4+7处理组中梨果的果香质量分数则持续下降,到贮藏结束时质量分数共下降了36.9%。而对照中梨果的果香质量分数在贮藏过程中先上升后下降,最后贮藏结束时果香质量分数与贮藏当天相比下降了15.2%。

酯香是西洋梨的特征香气之一,主要由氨基酸和脂肪酸的衍生物挥发产生,也是鸭梨的特征香气之一[29]。在本研究中,对照中的酯香质量分数在贮藏过程中由贮藏初期的16.8%下降至贮藏结束后的9.41%;而GA4+7处理组中的酯香质量分数在开始时是最低的(13.8%),并且随着贮藏时间的进行,下降到了7.70%。

青草香主要是由C6化合物形成,多在未成熟的梨果果皮中出现[25]。本研究中,贮藏当天,与对照相比,GA4+7处理组中的青草香质量分数较低(6.28%)。到贮藏结束时,对照组和GA4+7处理组中的青草香质量分数则由原来的18.7%和6.28%上升至30.8%和39.1%。

我们的分析结果表明,梨果果香的质量分数与梨果中的酯类物质发展趋势一致,而之前的研究也证明果香主要是梨果中带有果味的酯类物质所贡献,是梨果成熟期和贮藏期主要的特征香型[25,34]。所以,与对照组相比,GA4+7能增加梨果采摘时的果香香气。本研究中,酯香和青草香是由少量酯类还有一些醇类和醛类物质共同贡献出的香气。由贮藏当天的香韵分析得出,GA4+7处理组中的酯香质量分数与对照相比差异很小,而青草香质量分数却比对照组少很多。这或许是由于梨果采摘时,GA4+7处理组中含有的酯类物质含量高,尤其是能散发果味的酯类,这“弱化”了梨果青草香在所有香型中的质量分数。而在贮藏后期,GA4+7处理组中的酯类物质质量分数下降严重,这在“弱化”了果香的同时,也“加强”了其他的香型的质量分数,如青草香。

注:A:酯;B:冰;C:柑橘;D:乳酪;E:食品;F:水果;G:青,绿的;H:药草;K:松柏;L:芳香族化合物;M:铃兰花;N:麻醉性的;O:兰花;Q:香膏;R:玫瑰;U:动物香;V:香夹兰;W:木头;Y:土壤香;Z:有机溶剂。

表3 “香韵ABC”的三个值

表3(续)

3 结 论

本研究探讨了贮藏对赤霉素4+7处理过的黄冠梨中挥发物的影响。从挥发性物质的种类、质量浓度和数量、香气特征质量分数百分比分布等方面进行综合分析和评价分析,根据分析结果掌握GA4+7处理过的梨果在贮藏过程中挥发性物质的变化规律,全面阐明了在生长期施用GA4+7对梨果实贮藏期间挥发性成分的影响,最终发现赤霉素4+7植物生长调节剂处理过的梨果中的挥发性物质质量浓度和数量在贮藏期间下降迅速,尤其含量,到贮藏结束时与对照组相比多下降约13%,尽管其果味香型质量分数占比在贮藏当天比对照组高15.6%,但在贮藏期间也严重下降。这表明GA4+7会改善梨果贮藏初期的挥发性物质组成,但在贮藏过程中维持时间较短、下降迅速。以上结果为梨贮藏周期的确定和生产管理提供了重要的理论支持。