基于病证结合的冠心病动物模型制备研究进展与思考*

董雨蓉，解存，刘畅，赵佳，王朔

（1.天津医科大学胸科临床学院，天津 300070；2.天津大学胸科医院急诊科，天津 300222；3.天津市心血管危重症重点实验室，天津 300222；4.天津中医药大学中医药研究院，天津 301617；5.天津中医药大学组分中药国家重点实验室，天津 301617）

动物疾病模型是生物医学研究领域中不可或缺的工具，其制备方法是模拟人类疾病的发病机制，或通过模拟致病因素，造成典型或类似的病理状态，建立与人类疾病相应的动物模型[1]。建立合适的动物模型不仅能推进对于疾病发病机制的认识，而且可以为临床诊疗方式的改进及新药研发提供重要平台[2]。近年来，中医药将“病证结合”“方证对应”的临床诊疗方法引入动物模型的构建上，为深入探究中医证候生物学基础，实现中医临床辨证客观化、规范化，挖掘并创新中医理论提供了新的思路与方法。病证动物模型是在西医动物疾病模型制备方法的基础上，模拟临床辨病辨证的方法，通过加入中医干预因素，建立具有中医特色的动物模型[3]。

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是临床中致死率、致残率较高的心脑血管疾病，《中国心血管健康与疾病报告2021》显示，目前中国冠心病患病人数约为1 139 万，近20 年来中国冠心病的发病率增幅较大，上升20.6%，心脏病城乡病死率分别高达148.51/10 万、164.66/10 万，成为中国仅次于脑血管病的第二大疾病死亡原因[4]。中医将冠心病归于“胸痹、心痛”“真心痛”等范畴，认为本病往往与气滞、血瘀、痰浊、寒凝等实邪及气虚、阴虚、阳虚等虚损病理因素相关，具有本虚标实、虚实夹杂的病理性质，故衍生出多种中医证型的冠心病。目前，对于冠心病中医证型动物模型制备方法种类多样，但存在与临床病证相关性不强、稳定性较差、主客观指标不够明确、病理机制不够明晰等问题，因此文章通过对冠心病常用动物模型制备方法整理归纳，对冠心病中医证候动物模型的建立展开思考。

1 冠心病常用动物模型的制备方法

冠心病动物模型常用的动物有大鼠、小鼠、小型猪、兔、犬等，其选取主要以动物生理结构和功能与人的相似程度、实验目的以及实验的可操作性等为依据[5]。如大鼠及小鼠具有体积小、易于繁殖和饲养、操作性强、价格低廉等特点，运用最为广泛；小型猪的生理解剖和血液生化指标与人类接近，且因体积较大，可通过中兽医学“四诊”方法直观观测并掌握其症状与病情；犬的心血管功能与人相似，但主要用于毒理研究；兔对于高脂饮食极为敏感，容易复制高脂血症模型[6]。见表1。

表1 冠心病常用动物模型的制备方法汇总Tab.1 Summary of preparation methods of common animal models of CHD

1.1 手术损伤法

1.1.1 开胸手术造模 冠状动脉结扎术是最常用的方法。该方法是通过对麻醉状态下的实验动物冠状动脉分离处结扎，造成心肌局部缺血或坏死，复制临床中类似心肌梗死的动物模型[7]。实验动物根据心脏解剖结构的不同，结扎部位有所差异，如大鼠一般在左心耳与肺动脉圆锥之间，即冠状动脉左前降支（LAD）部位结扎；小型猪在LAD 中下1/3 部位结扎；犬在LAD 第1 对角支部位结扎；兔在LAD第1、2 对角支部位结扎。记录Ⅱ导联心电图，若ST段（ST-segment）抬高且结扎部位以下颜色发绀、搏动减弱为建模成功的标志。该方法阻塞冠状动脉分支对血管损伤较大，动物死亡率相对较高，因此手术时可滴注硝酸甘油预防血管痉挛，或喷洒利多卡因降低心脏对手术的反应刺激，同时密切关注动物心律及呼吸状态，及时进行抢救。

冠状动脉夹闭法原理与结扎法类似，是将分离出的冠状动脉通过无创动脉夹钳进行阻断，具有创伤小，操作简单的特点，主要用于心肌缺血再灌注损伤（MIRI）模型的制备[8]。由于对操作者分离冠状动脉的技术手法要求较高，没有结扎法运用广泛。

冠状动脉压迫法使用气囊梗阻器或水囊缩窄器固定于冠状动脉表面，通过控制球囊改变冠状动脉的血流流量，造成血液循环障碍，从而构建心肌缺血模型[9]。这种方法可控性强，可以模拟冠状动脉不完全狭窄和完全性狭窄的心肌缺血状态[10]。

吸水性的塑料环（Ameroid）缩窄法是在动物麻醉状态下开胸，将具有吸水性的Ameroid 环套在LAD 上，在闭合胸腔后，Ameroid 环塑料层会吸水膨胀，但由于其外层为金属构造，膨胀的塑料层只能逐渐向内挤压血管，造成慢性心肌缺血损伤[11]。该方法主要用于小型猪、犬等大型实验动物慢性心肌缺血模型的制备。

1.1.2 闭胸手术造模 闭胸手术法借助于临床中微创介入原理，一般是通过分离的颈总动脉将堵塞物（血栓栓塞或球囊）送入冠状动脉内造成血流终止[12]。该方法主要用于小型猪、犬等大型实验动物，具有创伤小、动物成活率高的特点。但对操作者技术手法、操作经验要求较高，且由于不同动物可能存在较大的体积差异，堵塞物大小不一，易造成较大的实验误差。

内膜损伤法是将球囊通过预置导管经颈总动脉进入冠状动脉，利用球囊机械性抽动导致血管内膜损伤，内膜平滑肌细胞增殖，造成管壁增厚管腔狭窄，模拟临床冠心病患者心肌缺血状态。该方法常用于小型猪心肌缺血模型的制备[13]。

微电流刺激法是用电极导管置于LAD 处释放微电流，刺激冠状动脉血管外膜使之受损，经生理性止血过程产生血栓或血管闭塞[14]。该方法操作损伤小，可以模拟急性冠状动脉综合征发生后产生的瘢痕组织。

1.2 药物造模

1.2.1 脑垂体后叶素（Pit）诱导法 Pit 的药物机制是大剂量注射致可使血栓烷A2 （TXA2）/前列环素（PGI2）异常，从而全身小血管收缩、冠状动脉痉挛，外周负荷增大，心肌耗氧增加从而导致心肌缺血[15]。此方法操作简便，且与冠心病心绞痛急性发作时的状态相近。大鼠一般可采取皮下注射、腹腔注射、舌下静脉推注等方式，兔采用耳缘静脉注射的方式进行模型的制备。

1.2.2 异丙肾上腺素（ISO）诱导法 连续注射ISO至动物体内，通过激动心脏β1 受体使心率加快，心肌收缩力增强，心肌耗氧量增大，导致氧供需失衡，造成心肌缺血损伤[16]。同时激动β2 受体使全身骨骼肌血管舒张，冠状动脉血管舒张，由于静脉给药舒张压明显下降，冠状动脉血流减少，加重心肌缺血状态。大鼠、小鼠可采用腹腔注射方式，兔采用耳缘静脉注射或腹腔注射方式进行模型的制备。

1.2.3 阿霉素（Dox）诱导法 将生理盐水配置的Dox 溶液连续注射至动物体内，刺激神经内分泌系统，造成心脏毒性，表现为心功能下降，即可说明心肌缺血[17]。大鼠、小鼠可采用尾静脉注射或腹腔注射方式进行模型的制备。

1.3 饮食诱导造模

1.3.1 高脂饮食 高脂饲料喂养诱导法通过喂养动物高脂饲料，使其机体发生脂代谢紊乱，动脉形成粥样硬化性斑块，并表现出心功能损伤的症状，即可说明心肌缺血[18]。该法主要适用于基因缺陷型小鼠心肌缺血模型的制备，如载脂蛋白E 缺陷（ApoE-/-）小鼠、低密度脂蛋白受体（LDL-R）缺陷小鼠等[19]。

1.3.2 维生素D3（VD3） VD3是钙离子诱导剂，通过大量的VD3灌胃，机体血钙升高，促使钙盐在动脉内膜中沉积，平滑肌细胞钙化或变性，血浆内脂质对动脉管壁发生侵蚀和损伤，从而建立冠状动脉粥样硬化模型[20]。

1.4 其他

1.4.1 运动负荷法 采用强迫跑台运动的方法，并采用声音、小木棍敲打、电击等刺激，使大鼠保持运动强度至力竭，以大鼠下跑台后腹部着地、四肢瘫软、翻正反射暂时消失作为模型成功的标准。力竭性运动使心脏处于高负荷状态，需氧量明显增加，导致心肌组织缺血缺氧，从而心电图呈现缺血性改变、心肌形态结构发生改变，并且心血管活性物质失衡加重心肌损伤[21]。

1.4.2 转基因动物模型 最常用的小鼠模型是ApoE 联合LDL-R 基因敲除。ApoE 缺乏会使脂质代谢紊乱，且LDL-R 基因缺失影响低密度脂蛋白的降解，从而脂质沉积于血管内皮产生粥样斑块[22-23]。在ApoE 和神经元型一氧化氮合酶（nNOSα）双基因敲除动物中，nNOSα 具有在血管受损后抑制内膜增生，预防动脉粥样硬化的作用，其遗传缺失则加速了动脉粥样硬化发生的风险。

目前制备冠心病动物模型的方法较为成熟，结合造模后动物的一般情况、生化指标、心电图表现及病理指标，来模拟临床症状和体征，选择制备具有相应实验目的的冠心病动物模型。一般来讲，手术法具有创伤大、程度重的特点，更加偏于模拟急性心肌缺血状态，药物及饮食法造模周期相对较长，用于模拟创伤程度相对较轻的慢性心肌缺血状态。冠心病结合中医证型模型的制备是当下研究热点，目前模型多在西医病因病理基础之上，结合中医对冠心病即“胸痹心痛”病机理论，而建立的病证结合动物模型。

2 冠心病中医证候动物模型的制备方法

根据《中医内科学》教材及《中药新药临床研究指导原则》，总结并列举常见冠心病中医证候动物模型，主要包括血瘀证（心血瘀阻证）、气虚血瘀证、气阴两虚证、痰瘀互结证、脾虚痰浊证、寒凝血瘀证等[3，24]。见表2。

表2 冠心病中医证候动物模型制备与评价指标Tab.2 Preparation and evaluation index of animal model of traditional Chinese medicine syndrome of CHD

2.1 血瘀证动物模型 血瘀证是最常见的冠心病中医证型，多因血行不畅，凝滞心脉，引起心胸刺痛，可见胸部固定性痛，舌质或舌体紫暗且有瘀斑瘀点，舌下静脉紫暗，口唇紫暗或暗红。

在大鼠高脂饲料饲养后的第7 日和第14 日分2 次进行VD3注射，并在饲养12 周大鼠主动脉斑块形成后，结扎LAD，以即时Ⅱ导联心电图所示ST 段弓背抬高，肉眼所见结扎部位以下心肌苍白作为判断模型成功建立的标准，并以养心通脉方作为“以方测证”的药物反证模型建立[25]。有学者采用高脂饲料喂养、VD3灌胃复合皮下多点注射ISO 方法造成实验大鼠心肌缺血，模拟心脉痹阻的情况，观察心电图J 点及ST 段的改变程度证实模型建立，并通过观察其代谢物的变化，发现血瘀证的特异性标志物[26-29]。蔺瑞等[30]采用Ameriod 缩窄环置入术建立模型，在第8 周时通过冠状动脉造影提示冠状动脉狭窄程度达99%，结合血脂、凝血、血流变指标升高，提示冠心病处于血瘀状态，证明模型建立成功。以上方法均可在一定程度上造成单纯或复合的冠状动脉血流速度减缓、内皮损伤或血液流变学改变，模拟临床中血瘀证的表现。

2.2 气虚血瘀证动物模型 气虚血瘀证是常见的虚实夹杂复合证型，多因气虚无力或血行瘀滞互为因果，引起心阳不振，瘀阻心脉之症，常有胸闷心悸，心痛如刺，精神疲惫，舌色暗淡或有斑点等临床表现，一般采用模拟“气虚+血瘀”的联合诱导方式制备模型。

采用LAD 结扎复合强迫跑步的方法模拟“气虚血瘀”状态，结合临床辨证依据，观察模型大鼠主症、兼症，将胸痛胸闷、心悸气短主症量化为心脏功能和呼吸幅度具体指标，身倦乏力、面色紫暗兼症量化为空场实验指标、力竭运动和舌底红-绿-蓝-色彩模式（RGB）值，并采集舌象RGB 值及脉搏幅度，以双参通冠方进行干预，全面观测上述证型表征，证明模型建立成功[31]。复合控制饮食、疲劳运动及冠状动脉结扎的方法建立冠心病气虚血瘀证大鼠模型，以心电图ST 段弓背抬高、舌色RGB 值改变、舌头苏木精-伊红（HE）染色法及PGI2、TXA2 的变化作为评价标准，从西医病理机制、中医辨证理论及微观生化指标方面证明该模型的成立[32]。采用游泳、高脂饲料饥饿饲养联合Pit 腹腔注射的方法建立的小鼠模型，通过中医证候评分量化气虚血瘀“证”的特征，观测心电图示T 波低平或倒置联合心率增快、血液黏稠微观指标模拟冠心病“病”的特征，以此评价“病证结合”的冠心病气虚血瘀证小鼠模型[33]。以上方法在“血瘀证”的基础上，从干预因素（疲劳运动、饮食控制）到症状表现（倦怠乏力、证候评分）再到理化客观指标复合临床“气虚证”的表现，更加贴合临床气虚血瘀证的发病机制及症状表现。

2.3 气阴两虚证动物模型 气阴两虚证是冠心病中后期常见的证型，多因心气虚损并见阴血不足，引起心神失养，心胸隐痛，表现为胸部隐痛或闷痛、神疲力乏、烦躁不安、舌红苔少或舌淡胖有齿痕。

采用小型猪为研究对象，通过经皮冠状动脉腔内血管成形术（PTCA） 球囊扩张导管阻塞LAD 血流，造成冠心病心肌缺血状态，其中心肌损伤致使心脏结构和功能表征指标下降，以及舌脉评分的变化均提示气阴两虚证病理及体征的改变，并以通脉养心丸和生脉胶囊干预，验证该模型评价指标的可靠性[34]。该模型用球囊加压阻断血流供应，并采用“以方测证”的方法结合客观指标进行评价，对研究气阴两虚证具有指导作用，但该证在临床中多为冠心病久病或老龄人群，因此制备模型时间较长。

2.4 痰瘀互结证动物模型 痰瘀互结证是随着现代疾病谱改变逐渐增多的一类复杂证型，多因脾虚生痰，气血瘀滞，相互搏结，引发心脉损伤，表现为胸部闷痛、唇舌青紫的“血瘀”，并见头昏乏力、身体肥胖、大便黏腻、舌苔肥腻、毛发油腻的“痰浊”症状。

陈洁等[35]用高脂高糖饲料喂养复合腹腔注射VD3建立痰瘀互结证大鼠模型，以大鼠造模后出现精神萎靡、嗜睡少动、反应迟缓，血脂检查见三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高，胸主动脉解剖见不稳定的粥样斑块提示造模成功。潘永明等[36]用长期高脂饲料喂养复合注射VD3+ISO 的方法建立模型，观察小型猪下腹部出现红色瘀斑、耳部瘀紫、喘息加快、趴伏烦躁或不动等心肌缺血的体征，舌苔厚腻、舌色紫暗、毛发油腻无光泽等情况来判定“痰瘀互结证”模型是否成功建立。李磊等[37]在高脂饲料喂养基础上，在冠状动脉造影后将球囊送入LAD 并进行拉动，造成冠状动脉损伤，模拟痰浊与血瘀并见的状态，检测血脂、血流变改变情况。使用小动物超声观察心功能变化，采集中医证候评分信息，综合评估冠心病痰瘀互结证小型猪模型的建立情况[37-38]。

课题组对比高脂饲料联合手术、药物造模的方法，发现采用高脂饲料喂养结合LAD 结扎术的方法，模拟“由痰致瘀、痰瘀互结”的病理变化来制备痰瘀互结证大鼠、小鼠模型，具有稳定性好、成模率高、可复制性强的特点[39-40]。以造模后血脂异常、HE染色脂肪细胞沉积作为“痰浊”的病理表现，以心功能降低、心肌纤维化作为“瘀血”的病理表现，并观察一般情况，检测血流变、心肌酶、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）指标改变及机制通路相关指标变化作为辅助提示该证型建立的参考依据[41-44]。通过丹蒌片干预冠心病痰瘀互结证大鼠模型，发现相关药理学指标、生化指标及代谢产物均有显著回调，进一步反证“病证结合”指导下痰瘀互结证模型的可靠性及实用性[45]。

2.5 脾虚痰浊证动物模型 因过食肥甘，脾失健运，聚生湿痰，久聚不散可损伤脉道，形成动脉粥样斑块，瘀塞心脉，表现为胸闷胸痛、胃脘痞满、肢体沉重、面色无华、纳呆、倦怠，多采用高脂饮食喂养制备模型。

在高脂饲料喂小型猪24 周后，观察发现小型猪出现类似于痰浊证的临床症状，如形体肥胖、毛发干枯及神志淡漠、舌色淡白、嗜睡懒惰的表现，进一步检测血清及心脏组织的血脂及生化指标水平，发现脂质水平及内皮功能均出现明显损伤，提示脾虚痰浊证小型猪模型建立成功[46]。采用高脂饲料喂养及腹腔注射VD3建立大鼠模型，通过观察大鼠一般情况及主动脉病理学染色，检测血脂及炎症、内皮损伤指标，发现该模型出现粥样斑块沉积、脂质过氧化表现，符合脾虚痰浊证的病理变化[47]。用隔日游泳、高脂饲料喂养联合冠状动脉结扎法制备冠心病“脾虚生痰”型小型猪模型，心肌细胞病理学及缺血区超微结构显示心肌细胞结构破坏，线粒体肿胀，炎性因子蛋白及信使RNA（mRNA）表达明显增高，提示痰浊内生加剧心脏损伤[48]。该模型主要仍以高脂饲料喂养模拟痰浊壅盛的病理性质，复合微观指标提示心脏损伤，从而制备脾虚痰浊的动物模型。

2.6 寒凝血瘀证动物模型 寒凝血瘀证也是临床常见的冠心病证型，多因阴寒凝滞，闭阻阳气，发为骤然心痛，表现为胸痛遇寒而发或猝然心痛、面色苍白、畏寒肢冷、舌色紫暗症状。

通过将大鼠间断反复冷刺激将大鼠置于寒冷/复温的环境，模拟寒邪凝滞的病机，加之Pit 注射造成心肌缺血的血瘀病机，构建寒凝血瘀证的动物模型，将宏观表征（体温下降、唇周爪子黏膜颜色变浅、心率降低等）和微观指标[微静脉收缩、血液流速减慢、血浆TXB2、大鼠6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）值升高等]作为寒凝血瘀证大鼠模型建立的诊断标准[49]。该造模方法通过寒冷刺激的方式模拟因寒致病的病理机制，联合理化指标反映血管痉挛、血流变改变、心肌微循环障碍等血瘀病理性质，但存在无法模拟临床猝然胸痛的客观表现等问题。

上述方法是目前制备冠心病病证结合模型最为常见的，多是在中医理论指导下，西医病理模型复合多因素模拟中医病因病机建立证候模型，主要通过观察实验动物的一般情况，结合相关生化指标建立证候模型，一定程度上体现出中医病证结合的特色，可与中医临床辨治相对应。

3 讨论

3.1 中医与西医对冠心病实验动物模型建立的比较 冠心病动物模型的制备是模拟人类冠心病病因病机所致的病理状态，其基础仍以西医病理学为基础，是连接基础研究和临床应用的重要工具。西医冠心病动物模型多施加单一物理、化学、生物手段，造成实验动物组织器官损伤，模拟冠心病发展某一阶段典型或类似的病理状态，具有操作简便、模型稳定、公认度较高的特点[50]。而中医冠心病动物模型则是结合中医辨证论治原则，多采用西医病理模型复合中医病因病机的造模方法，更具中医药病证结合研究特色，更贴合中医认识冠心病的角度和思路，但普遍来讲，中医冠心病动物模型制备及评价方法尚未形成研究领域统一标准，因此推广度较差、公认度较低[51]。

3.2 病证结合动物模型制备的实践与认识 以冠心病痰瘀互结证大鼠、小鼠模型建立为例，课题组依据“脾虚生痰，心脉瘀阻，终致痰瘀搏结”的病机演变规律模拟建立动物模型，参照临床获得的客观化、特异性指标在实验动物上进行佐证，并进行方证对应的相关研究，形成了较为系统的冠心病痰瘀互结证病证结合研究思路，总结以下几个特点。

3.2.1 病证结合，反映中医辨证思路及特色 西医认为冠心病的病理基础为各种原因导致的心肌供氧和需氧失衡，造成冠状动脉粥样硬化不断累积，引起斑块破裂，导致心脏功能受损，中医将其归因于瘀血痹阻心脉，并认为脾虚导致的痰浊内生，是冠心病发生的始动因素[52]。基于上述认识，在模型制备时，先采用高脂饮食的方式进行喂养，模拟“痰浊”的病理状态，并采用结扎的方法阻断冠状动脉血流，模拟西医心肌缺血的病理状态，即中医的“血瘀”病理性质，并通过指标检测证明复合的证候模型病变程度重于单一证候模型，并与临床症状相吻合，即判定为“痰瘀互结”模型制备成功。

3.2.2 方证对应，反证动物模型的稳定性 丹蒌方作为治疗冠心病痰瘀互结证临床的辨治用药，在“以方测证”原则指导下，分别给予冠心病痰瘀互结证大鼠、小鼠灌胃干预，通过观测模型建立和评价相关指标的改善，反证该模型的可靠性、稳定性和科学性。此外，通过将临床研究获得的证型特异性指标，如过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、白细胞介素-6（IL-6）、血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）等在动物实验层面进行验证，并观察动物有临床患者的类似体征（一般情况、舌紫暗等），形成结合宏观表征与微观辨证的研究方法，进一步验证该模型的可信度，明确该模型在病理层面的作用机制，为中医药“病-证-方”对应研究提供研究方向。

3.2.3 中西汇通，融合现代生物分析技术 采用系统生物学及药物化学分析技术，将组学分析手段引入冠心病痰瘀互结证分子水平领域的探索研究，找到其特异性组学生物标志物，也为揭示冠心病痰瘀互结证的证候规律及意义提供依据。课题组采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法（UPLC-QTOF/MS）检测经丹蒌片干预后冠心病痰瘀互结证大鼠血清中代谢物的变化，发现亚油酸、γ-亚麻酸和溶血磷脂酰胆碱出现明显回调变化，也可作为冠心病痰瘀互结证微观辨证的代谢生物标志物，为中医证候的研究提供研究思路。

3.3 不足与展望 目前，病证结合的冠心病实验动物制备方法已成为中医药领域内中医病因病机探索、证候类型比较、中药新药开发、药效物质基础等基础研究的重要工具和手段，一定程度上推动了中医药科研的客观化、现代化。就动物模型本身而言，现有的制备方法不可能完全模拟人类冠心病动脉斑块破裂引起的血管内皮损伤，最终导致心脏功能受损的致病机制，只是反映某一病理阶段的具体表现，主要通过动物生化指标结果提示具有类似的病理机制。加之中医辨证所创造的复合模型，仅是从中医理论角度出发，对中医临床实际进行了模拟，且未形成公认的客观评价标准和研究路径，故部分学者对病证结合模型持有怀疑或否认的态度[53]。此外，中医诊断主要通过望、闻、问、切4 个方面获取诊断信息，然而其中的“问”询问患者的主观感受以及“切”切脉来判断阴阳表里、寒热虚实等相关情况无法在实验动物上实现，这是无法跨越的壁垒，且对于实验动物生活状态、饮食情况、身体状况等变化情况的客观化标准，冠心病病证结合动物模型的发展之路仍需要不断探索和完善[54]。