脑脊液特征指标辅助结核性脑膜炎快速筛查的效果评估

汪晨媛 王珊珊 王赛楠 邵戈 曹佳颐 熊海燕 胡屹

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是最严重的肺外结核,也是最常见的中枢神经系统结核[1-2]。虽然TBM患者例数仅占全球结核病患者例数的1%,但其病死率可高达30%～40%,且中枢神经系统后遗症风险较高[3]。

TBM的早期发现可有效降低病死率和致残率,阻断疾病传播。TBM的临床表现通常为发热、头痛、易怒、颈部僵硬和呕吐[4],但这些症状往往并不典型。世界卫生组织(WHO)和我国已广泛推广快速分子检测方法用于结核病的筛查和防控[5-6]。但目前常用的快速筛查技术对于TBM的早期发现仍有一定不足,而传统的涂片和培养方法也存在耗时较长、培阳率低等问题。因此,总体上TBM的诊断及时性、准确性有待改善,这也直接影响到患者的疾病进程和临床治疗[7]。此外,部分TBM患者症状具有一定隐匿性,存在长期接受不正确治疗、病情延误、反复就医等情况,不仅增加患者死亡风险,还可造成更多耐药菌株的出现和在社区和医院内传播,形成严重的社会公共卫生风险。TBM患者根据临床相关病例定义分为确诊TBM、很可能TBM和可能TBM[5]。除确诊TBM患者涂片或培养的结果明确外,另两类TBM患者早期发现往往较难,主要因患者体内的结核分枝杆菌载量较低。因此,完善TBM的快速筛查技术具有较高的临床和公共卫生意义,当前亟需完善简单易行的诊断技术,特别是可用于早期发现很可能和可能TBM的筛查技术。

由于TBM患者的血脑屏障通透性增加,其脑脊液成分可能发生改变[8]。因此,一些特定脑脊液生化和代谢指标可能对于TBM患者的辅助诊断具有一定价值[9],从而提高很可能和可能TBM患者早期筛查技术的准确性[10]。现有关肺外结核快速筛查的研究主要集中于对各类快速诊断技术的效果评估[8],如显微镜检查、核酸扩增技术、γ-干扰素释放试验等,但尚缺乏考虑生化指标辅助快速筛查的相关文献报告。本研究针对多地TBM疑似患者,回顾性收集患者资料,通过代谢组学分析,筛选差异代谢物质,结合多指标提高疾病的诊断准确性,有助于及早发现患者,采取早期针对性治疗和防控措施,降低患者的死亡率、致残率及控制结核病的进一步传播。

对象和方法

一、研究对象

采用回顾性研究方法,利用2011—2019年在江苏省苏州市、四川省自贡市和贵州省贵阳市的结核病定点医疗机构数据实施。收集研究期间上述定点机构登记的21 736例结核病患者,其中有1种或多种临床表现(发热、头痛、烦躁、呕吐、颈部僵硬、意识改变、嗜睡或局部神经损伤)的疑似TBM患者共521例。根据纳入排除标准,排除127例入院时无明确诊断的患者、9例有严重凝血功能障碍的患者和2例妊娠期患者,最终共纳入383例研究对象。

根据临床相关病例定义[5],在383例研究对象中随机抽取100例临床诊断TBM患者(包括69例确诊TBM患者和31例很可能或可能TBM患者;TBM组),并按年龄、性别1∶1配对抽取100例非TBM患者(包括病毒性脑膜炎32例、细菌性脑膜炎33例和隐球菌性脑膜炎35例;非TBM组)为对照,共计200例。筛选流程见图1。

注 TBM:结核性胸膜炎

二、纳入和排除标准

1.纳入标准:(1)患者初诊疑似TBM;(2)HIV阴性;(3)知情同意。

2.排除标准:(1)入院时无明确诊断;(2)有严重的凝血功能障碍;(3)有明显的腰椎穿刺禁忌证;(4)妊娠。

根据临床相关病例定义[5],本研究将TBM的诊断分类确定如下:(1)确诊TBM(69例):为获得结核分枝杆菌的传统微生物学或核酸扩增试验阳性证据;(2)很可能TBM(9例):为缺乏颅内病原学诊断依据下,临床上出现发热、呕吐、易激惹、脑膜刺激征、抽搐、局灶性神经损伤、意识状态改变中的1项或多项表现,诊断评分≥12分(有脑影像学检查)或≥10分(无脑影像学检查),脑影像学或脑脊液至少2分;(3)可能TBM(22例):诊断评分为6～11分(有脑影像学资料)或6～9分(无脑影像学资料);(4)非TBM(100例):未被诊断为上述几类TBM的患者,经其他非结核源性病原体检测,确定为非结核性脑膜炎。

三、研究设计

对所有纳入对象开始抗结核治疗前,采集脑脊液样本-80 ℃冻存,分别进行生化检测和GeneXpert MTB/RIF检测。检测脑脊液白细胞计数、乳酸、蛋白总量、腺苷脱氨酶、葡萄糖等生化指标。生化检测均按照标准检验流程操作,并进行质量控制。对患者脑脊液样本以高效液相色谱法分离代谢物并检测。高效液相色谱由研究者统一送检,且检测过程设置质控样本。将200例研究对象数据作为训练集,在此200例之外的183例纳入对象中随机抽取30例作为验证集。以非TBM组为对照,在训练集中通过机器学习方法筛选出具有潜在诊断价值的生化指标或代谢物指标,并对这些指标对于TBM的快速识别效能在验证集中进行评估。本研究已获得复旦大学公共卫生伦理委员会批准(IRB#2015-11-0568)。所有研究对象均知情同意。

四、统计学处理

采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。计量资料呈偏态分布,以“中位数(四分位数)M(Q1,Q3)”描述,组间差异的比较采用Mann-WhitneyU检验;计数资料以“构成比/百分率(%)”描述,组间差异的比较采用卡方检验。使用SIMCA软件,运用偏正交最小二乘判别法分析(OPLS-DA)计算各代谢物质液相色谱峰面积在两组间的差异,通过独立样本非参数检验、OPLS-DA模型变量权重(variable important in projection)和代谢物组间表达量的差异倍数(fold change)进行判别分析,获取可靠的代谢物组间差异。根据受试者工作特征曲线计算上述代谢物水平,用于以临床病例定义为参考标准的各类型TBM检测的敏感度和特异度及约登指数。

进一步使用Salford Predictive Modeler v8.0软件导入生化指标(脑脊液白细胞计数、乳酸、蛋白总量、腺苷脱氨酶、葡萄糖)和上一步筛选的代谢物指标进行机器学习,构建决策树模型(Boosted-CART),明确潜在筛查指标及其cut-off值。为抑制过拟合,对boosted-CART进行剪枝形成以主要指标变量为分枝节点、指标取值能较好区分TBM样本和非TBM患者样本的最终模型[11]。根据模型中的指标取值,通过AUC评估特定生化和代谢物指标对于很可能和可能TBM的检出效果。提升效果指标验证公式如下:

其中,Z:统计检验值;SE:标准误;AUC:曲线下面积;NORMSDIST:返回标准正态累积分布函数。

结 果

一、一般特征

200例纳入的研究对象中,共有100例临床诊断TBM患者(TBM组)和100例非TBM患者(非TBM组)。TBM组和非TBM组在性别、年龄、地区分布的差异均无统计学意义(P值均>0.05),见表1。

表1 研究对象的一般特征

二、特征代谢物筛选

根据模型得分散点图判断,两组样本组间差距大,组内重复性较好,区分明显。模型经随机置换检验可知,能够较好解释两组样本之间的差异,且具有良好的稳健性,不存在过拟合。

经过检测,最终获得95个TBM脑脊液代谢物结果,98个非TBM脑脊液代谢物结果,共计193个脑脊液代谢物结果。在SIMCA软件中分析代谢物结果的出峰面积,经OPLS-DA,共筛选出6种代谢物(L-异亮氨酸、β-丙氨酸、L-谷氨酰胺、黄嘌呤、D-丙氨酸、L-赖氨酸)在TBM患者的脑脊液中呈上调趋势,含量高于非TBM组(图2,3),差异均有统计学意义(P值均<0.001),且AUC值均在0.7～0.9之间,见表2。

表2 结核性脑膜炎患者脑脊液代谢差异物质检出表现

注 0:非结核性胸膜炎组;1:结核性胸膜炎组;红色表示该物质表达较高,蓝色表示该物质表达较低

注 0:非结核性胸膜炎组;1:结核性胸膜炎组;红色表示该物质表达较高,蓝色表示该物质表达较低

三、提高敏感度的指标筛选及筛查表现

将训练集对象的生化指标和6种代谢差异物(L-异亮氨酸、β-丙氨酸、L-谷氨酰胺、黄嘌呤、D-丙氨酸、L-赖氨酸)指标导入机器学习boosted-CART模型。最终生成的树状模型中,代谢物指标中的L-谷氨酰胺和生化指标中的脑脊液葡萄糖被选择为特征指标,其cut-off值分别为607.06 mmol/L(L-谷氨酰胺)和60.03 mg/dl(葡萄糖),见图4。

图4 boosted-CART模型选择特征指标及其cut-off值

在验证集30例患者中,L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L可识别出9例(50.0%)TBM,AUC值为0.750(95%CI:0.577～0.923)。L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L和脑脊液葡萄糖>60.03 mg/dl联用可识别出10例(55.6%)TBM,AUC值为0.778(95%CI:0.612～0.943),但相较于L-谷氨酰胺提升不明显(Z=0.230,P>0.05)。对于确诊的TBM患者,L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L可识别出5例(41.7%)TBM,AUC值为0.917(95%CI:0.734～1.000)。L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L和脑脊液葡萄糖>60.03 mg/dl联用并不能识别出更多的患者。对于很可能和可能TBM患者,L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L可识别出4例(66.7%)TBM,AUC值为0.667(95%CI:0.444～0.889)。L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L和脑脊液葡萄糖>60.03 mg/dl联用可识别出5例(83.3%)TBM,AUC值为0.708(95%CI:0.494～0.923),但相较于L-谷氨酰胺提升不明显(Z=0.261,P>0.05)。具体见表3。

表3 L-谷氨酰胺和脑脊液葡萄糖用于筛查结核性脑膜炎的表现

讨 论

本研究发现,葡萄糖和L-谷氨酰胺联用可明显提高TBM检出的敏感度,有利于快速识别潜在患者,特别是既往难以发现的很可能和可能TBM患者,以利于早诊早治、改善预后和控制结核病(特别是耐药菌株)在社区和医院内进一步传播。

高葡萄糖和高L-谷氨酰胺等生化和代谢物指标的变化可能与TBM的进展与代谢改变有关。持续代谢紊乱的后果是葡萄糖代谢失控,快速使用葡萄糖导致糖酵解增加,表明存在较高的能量需求。在受影响的脑细胞中,存在从有氧代谢到无氧代谢的转变[12]。患者脑脊液中,结核分枝杆菌的生长需要更多葡萄糖来应对能量消耗[13],可能使初期脑脊液葡萄糖水平明显升高。此外,神经系统免疫细胞在对抗结核分枝杆菌感染的过程中被大量激活,从而需要更高的脑脊液葡萄糖水平以支持其活动[14]。但随着疾病发展,患者脑脊液葡萄糖含量逐步降低,最终甚至低于一般水平。

罹患TBM会对患者氨基酸代谢产生较大影响,故关注脑脊液中氨基酸代谢过程的改变情况,可以在一定程度上提示脑部病变的可能。TBM患者脑脊液谷氨酰胺的升高可能来源于谷氨酸-谷氨酰胺循环遭到破坏,此过程可能因星形胶质细胞和神经元转运体功能的降低导致[14],提示炎症对中枢神经系统存在影响。另一种可能的机制是,血脑屏障功能降低或改变导致血脑屏障通透性改变,如谷氨酸通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体[15]和改变脑内皮细胞紧密连接蛋白的表达来诱导血脑屏障通透性变化[16]。

本研究结果发现,通过L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L和脑脊液葡萄糖>60.03 mg/dl可识别更多潜在的TBM患者。前期已有研究指出,脑脊液葡萄糖对于TBM的辅助诊断有一定的指示作用[17]。南非一项研究采用>33 mg/dl的脑脊液葡萄糖水平,诊断敏感度达到91.49%[14]。本研究中,对于很可能和可能TBM患者,L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L联用高于60.03 mg/dl脑脊液葡萄糖水平可将敏感度大幅提高至83.3%,显示出更好的筛查效果。通过本研究发现的生化和代谢物等检测,可在检测复杂度和成本均可接受的前提下,大幅提高TBM,特别是既往较难发现的很可能和可能TBM的筛查敏感度,改善诊断的时效性和准确性,也有利于快速鉴别诊断TBM患者并开展早期治疗和隔离管控措施,具有较好的可操作性、临床价值和公共卫生意义。

综上所述,脑脊液葡萄糖和L-谷氨酰胺都在不同程度上提高了TBM的检出敏感度,尤其对于传统诊断方法难以发现的早期病例,两者联用能进一步提高TBM的敏感度,虽提升不够明显(P>0.05),但相较于传统诊断方法10%～60%的敏感度[18],两者都具有一定优势。本研究旨在通过提高TBM早期发现和检出,降低疾病的致死率和致残率。随着诊断技术的不断发展,未来可将这些生化和代谢物指标纳入更先进的诊断平台,以提高检测的敏感度和特异度。此外,进一步的研究应探讨这些生化指标与TBM病理生理过程的关系,以深入了解疾病机制。

本研究存在一定局限性。若考虑个体遗传背景、环境因素和疾病严重程度,则本研究结论的外推需要纳入更多患者及不同疾病阶段患者。另外,本研究对照组为非TBM患者,故研究结果仅适用于鉴别诊断,不适用于一般人群筛查。此外,本研究暂未考虑可能造成脑脊液葡萄糖改变的其他潜在因素,以及患者感染特征、就诊时间和共病情况等的影响。未来应扩大样本量,特别是不同疾病阶段的患者,以增强结论的代表性和外推性。进一步研究疾病机制,了解影响脑脊液代谢物的其他潜在因素。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献汪晨媛:论文构思、方法验证、形式分析、初稿写作、可视化呈现;王珊珊:审核与编辑写作;王赛楠和邵戈:可视化呈现;曹佳颐和熊海燕:项目管理;胡屹:数据管理、项目管理、审核与编辑写作