暖骨风多酚的提取工艺优化及其抗氧化和抑菌性的初步研究

■ 郭 松 肖善芳 江凯欣 梁湘兰

（1.广西科技师范学院食品与生化工程学院，广西来宾 546199；2.广西科技师范学院壮瑶药品质生物学重点实验室，广西来宾 546199）

暖骨风，别名为一身保暖、山瑞香，是瑞香科、瑞香属植物毛瑞香[Daphne kiusianaMiq.var.atrocaulis(Rehd.) F.Maekawa]的全株[1]。瑶医中最具有代表性的经典瑶药为“五虎、九牛、十八钻、七十二风”，其主要有104 味传统瑶药，被瑶医尊称为“老班药”[2]，暖骨风属于“风”类瑶药的一种，具有祛风除湿、调经止痛等功效。瑶医常用其煲汤煮水，或与其他中药如牛大力等炖汤，治疗阳虚怕冷、手脚冰凉等症状。

研究者指出，我国传统的日粮模型缺乏微量的具有特殊生理活性功能的天然植物生物活性物质，导致动物营养不充分、不平衡，影响动物健康和生态环境[3]。植物多酚是植物在生长与繁殖过程中经非必须代谢途径所生成的有机化合物，具有抗氧化、调节免疫、抑制有害菌、抗病毒、消除炎症、促进消化及改善肉品质等多种生物学功能，具有多途径、多靶点、纯天然、无污染、无残留、无耐药性等特点，被认为是理想的抗生素替代品[3-5]，对于饲料工业的相关研究具有重要的开发利用价值。多酚常见的提取方法有溶剂提取法、超声波辅助提取法、超临界CO2及亚临界水萃取法等[6-7]。其中，超声波辅助提取主要是利用超声波形成的剧烈振动和空化效应以及搅拌作用使植物的细胞结构被破坏，再与溶剂浸提法相结合达到提取的目的，其具有缩短提取时间、提取量高、操作简单的优点[8-9]。

研究以瑶药暖骨风为原料，对暖骨风多酚的提取工艺进行优化，并对暖骨风多酚的抗氧化能力及其抑菌性进行测定，为暖骨风多酚的开发利用以及生物活性的研究提供理论根据。

1 材料与方法

1.1 材料

瑶药暖骨风：购置于广西壮族自治区金秀瑶族自治县瑶医医院。样本同时保存在广西科技师范学院食品与生化工程学院工科楼实验室。

乙醇、甲醇（AR）等常规有机试剂均为分析纯，购置于成都市科隆化学品有限公司；抗氧化测定试剂盒购置于北京索莱宝科技有限公司。E.coli和SA 为广西科技师范学院食品与生化工程学院保存。

1.2 主要仪器与设备

CS-2500Y 高速多功能粉碎机，武义海纳电器有限公司；ATY224 电子天平，岛津菲律宾工厂；KQ3200DE 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；H1850 台式高速离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；RE-52AA 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；GZX-GF101BS 恒温干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；SPX-250 生化培养箱，上海申贤恒温设备厂；YXQ-50S 高压蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ2F 洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；UV-5100 可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

将瑶药暖骨风在50 ℃条件下过夜干燥至恒重，并粉碎，过50目筛，干燥处保存备用。

1.3.2 没食子酸标准曲线的建立与暖骨风多酚提取量计算

参考周浓等[10]的方法对多酚的含量进行测定，试验方法简要介绍如下：精密称取0.025 0 g 没食子酸标准品，定容至250 mL，配制质量浓度为0.1 mg/mL 的没食子酸标准品溶液。再用移液枪将其吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分别置于50 mL容量瓶中，加入福林酚试剂4.0 mL，摇晃均匀，静置5 min，加入浓度为10% Na2CO3溶液4.0 mL，同时以不加没食子酸标准溶液为空白对照组，充分混合均匀后定容，避光、室温静置反应1 h，于760 nm 波长处测定吸光度，同时做三次平行试验，并取平均值。横坐标为质量浓度，纵坐标为吸光度，建立标准曲线，得出相应的回归方程。

将没食子酸换成暖骨风多酚提取物，用相同的步骤测定吸光度，通过回归方程，计算多酚的质量浓度，并计算多酚的提取量。

式中：C——质量浓度（mg/mL）；

V——定容体积（mL）；

N——稀释倍数；

W——暖骨风粉末的质量（g）。

1.3.3 影响暖骨风多酚提取的单因素试验

1.3.3.1 乙醇体积浓度影响暖骨风多酚提取的单因素试验

精密称取0.500 0 g暖骨风粉末，在40 ℃、50 min的超声条件下，按照1∶50 g/mL的料液比，分别加入乙醇体积浓度为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液进行超声提取，并以5 000 r/min的转速对提取液进行离心15 min。离心结束后用移液枪吸取1.0 mL上清液，转移到50 mL的容量瓶中，其余步骤同1.3.2，以蒸馏水作为空白对照，考察不同体积浓度的乙醇溶液对暖骨风多酚提取量的影响，以确定较佳的乙醇体积浓度。

1.3.3.2 料液比影响暖骨风多酚提取的单因素试验

精密称取0.500 0 g 暖骨风粉末，在40 ℃、50 min的超声条件下，加入乙醇体积浓度为60%的乙醇溶液，分别按照1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50 g/mL的料液比进行超声提取，其余步骤同1.3.3.1，考察不同的料液比对暖骨风中多酚提取量的影响以确定较佳的料液比。

1.3.3.3 超声时间影响暖骨风多酚提取的单因素试验

精密称取0.500 0 g 暖骨风粉末，在超声温度为40 ℃条件下，按照1∶35 g/mL 的料液比加入乙醇体积浓度为60%的乙醇，分别在40、45、50、55、60 min的时间下进行超声提取，其余步骤同1.3.3.1，考察不同的超声时间对暖骨风中多酚提取量的影响，以确定较佳的超时时间。

1.3.3.4 超声温度影响暖骨风多酚提取的单因素试验

精密称取0.500 0 g 暖骨风粉末，在超声时间为55 min条件下，按照1∶35 g/mL的料液比加入乙醇体积浓度为60%的乙醇，分别在45、50、55、60、65 ℃的温度下进行超声提取，其余步骤同1.3.3.1，考察不同的超声温度对暖骨风中多酚提取量的影响以确定较佳的超声温度。

1.3.4 暖骨风多酚提取的响应面优化试验

根据单因素的结果，使用Design Expert 11 软件，进行试验设计，多酚含量作为响应值，料液比（A）、超声时间（B）、超声温度（C）作3 个自变量，进行3 因素3水平的试验，通过对试验数据进行分析来确定提取的最优条件，响应面水平因素见表1。

表1 响应面设计因素及水平

1.3.5 暖骨风多酚抗氧化能力试验

1.3.5.1 总抗氧化能力标准曲线的绘制

以FeSO4·7H2O 作为测定总抗氧化能力的标准品，在使用标准品之前应放入0.9 mL 的超纯水和0.02 mL 的浓硫酸，配制成FeSO4标准溶液，其浓度为40 μmol/mL，然后再使用超纯水将标准溶液配制成0.075、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.003 125、0.001 56、0.000 78 μmol/mL，备用。在593 nm 的波长下，测定不同浓度的标准溶液的吸光度，建立标准曲线，横坐标为标准溶液的浓度，纵坐标为吸光度，得到相应的回归方程：y=20.753x-0.005 8（R2=0.999）。

1.3.5.2 总抗氧化能力试验

总抗氧化能力可以使用总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒进行测定[11]。将暖骨风在最佳条件下进行提取，再进行离心，离心后将提取液用旋转蒸发器在55 ℃下进行旋蒸，得到膏状物。准确称取2.000 0 g膏状物，再用20%的二甲基亚砜定容至20 mL，得到100 mg/mL暖骨风多酚原液。

用暖骨风多酚原液先配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 不同浓度的样品溶液，再参考试剂盒的使用手册，测定593 nm 下吸光值，以VC 作为空白对照，并计算暖骨风中多酚的总抗氧化能力。

式中：x——样品溶液的浓度（mg/mL）；

V反总——反应过程中的总体积（mL），1.02 mL；

V样——反应过程中的样本体积（mL），0.03 mL。

1.3.6 暖骨风多酚抗菌性试验

1.3.6.1 菌悬液的制备

使用不含有任何细菌的生理盐水，将一定量活化的SA和E.coil菌种配制成每毫升含有菌106～107CFU的菌悬液[12]，备用。

1.3.6.2 抑菌活性的测定

采用滤纸片法[13]，将灭菌好的6 mm 的滤纸片放于100 mg/mL 的暖骨风多酚样液中浸泡30 min，同时将灭菌好的6 mm 的滤纸片分别用无菌水、青霉素、硫酸链霉素进行浸泡，无菌水进行参比对照，以青霉素、硫酸链霉素分别作为SA 及E.coil的阳性对照。分别取两种细菌的菌悬液500 μL 放入到无菌固体LB 培养基中，然后对其进行涂布，涂布的同时要保证整体均匀性，再用无菌镊子将提前浸泡过暖骨风多酚样液、无菌水、青霉素及链霉素的滤纸片加入到含有细菌的LB 培养基中，37 ℃培养16～24 h，并测量所形成抑菌圈的大小（mm）。

1.3.6.3 最低抑菌浓度的测定

采用二倍数稀释法，取1 mL100 mg/mL 的暖骨风多酚样液于1 号试管中，再加入1 mL 20%二甲基亚砜，混匀后得到50 mg/mL 的暖骨风多酚样液，再从1 号试管中取50 mg/mL的暖骨风多酚样液1 mL于2号试管中，再加入20%的二甲基亚砜1 mL，混匀后得到25 mg/mL 的暖骨风多酚样液，以此类推稀释到5 号管得到3.125 mg/mL 的暖骨风多酚样液。分别取1 mL不同浓度的暖骨风多酚样液，加入到等量的LB 培养基中，将它们进行充分混匀后，待LB 培养基凝固后，分别取E.coli及SA 的菌悬液200 μL 加到混合固体LB 培养基中。在37 ℃条件下培养24 h，观察是否有菌落生成。同时，以无菌水作为空白对照。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线的建立

以质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，可以得到没食子酸的标准曲线，由图1 可以看出，拟合线性回归方程为y=0.090 6x-0.002，其相关系数R²=0.999 2，说明拟合程度较好，同时说明了在2～12 μg/mL 范围内，线性关系也比较好。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 影响暖骨风多酚提取的单因素试验结果

2.2.1 乙醇溶液影响暖骨风多酚提取的单因素试验

由图2 可知，乙醇体积浓度为30%～60%时，暖骨风的多酚提取量随乙醇体积浓度的升高而增加。当乙醇的体积浓度达到60%时，暖骨风多酚的提取量达到最大值。这可能是因为乙醇体积浓度过低对氢键的破坏作用较小，酚类化合物难以溶解出来[14]，但当乙醇体积浓度高于60%时，暖骨风的多酚提取量随乙醇体积浓度的升高而降低，可能是乙醇浓度高于60%会导致细胞的蛋白质发生变性[15]，影响多酚类物质的溶出，同时其他的非酚类且具有可溶性的物质溶解度会不断增大，导致多酚的提取量下降。由此认为，乙醇体积浓度为60%是暖骨风多酚提取的最佳条件。

图2 暖骨风多酚在不同乙醇体积浓度下的提取量

2.2.2 料液比影响暖骨风多酚提取的单因素试验

如图3，料液比上升到1∶35 g/mL 时，多酚的提取量达到峰值，再继续提高料液比，多酚的提取量会降低。暖骨风需要吸收足够的溶剂才能充分溶胀，从而有利于多酚和其他活性物质的溶出[16]。但是提取溶剂体积过大，会使多糖、蛋白质等杂质溶解析出，从而造成多酚提取量降低[17]，且过高的料液比容易增强超声波对植物细胞阻力的破坏，造成暖骨风多酚溶出量减少，导致多酚的提取量降低[18]。由此认为，料液比为1∶35 g/mL是暖骨风多酚提取的最佳条件。

图3 暖骨风多酚在不同料液比下的提取量

2.2.3 超声时间影响暖骨风多酚提取的单因素试验

如图4，超声所用时间越长，暖骨风多酚的提取量也越大，达到55 min 时，暖骨风多酚的提取量达到最大值；但当超声提取时间超过55 min 时，暖骨风多酚的提取量会随着超声时间的延长而下降。超声辅助提取主要是使暖骨风在较高频率的振动中，通过超声波产生的空化作用、热效应以及搅拌作用等进行辅助提取[19]。合理地延长超声时间有利于超声波空化作用的产生，能够使多酚从提取溶剂中分离出来，提高多酚的提取量。但超过最佳提取时间而继续延长超声时间，可能会因为较长时间的空化作用导致多酚在长时间且高温的条件下遭受破坏[20]。由此认为，超声时间为55 min是暖骨风多酚提取的最佳条件。

图4 暖骨风多酚在不同超声时间下的提取量

2.2.4 超声温度影响暖骨风多酚提取的单因素试验

如图5，随着超声波处理的温度提高，暖骨风多酚的提取量也会相应的提高。在55 ℃的超声波作用下，暖骨风的多酚提取量达到最大值。但当超声波的温度高于55 ℃时，暖骨风多酚的提取量会随之升高而降低。可能是当超声温度高于55 ℃时，随着超声温度的升高，会破坏部分不稳定多酚类成分的结构，进而造成暖骨风多酚提取量下降。由此认为，超声温度为55 ℃是暖骨风多酚提取的最佳条件。

图5 暖骨风多酚在不同超声温度下的提取量

2.3 暖骨风多酚的响应面结果及分析

2.3.1 响应面结果及分析

以-1、0 及1 对所选因素和水平进行编码[21]，优化暖骨风中多酚类物质的提取工艺条件，响应面的设计及结果见表2。根据表2 的结果，使用Design-Expert 11 软件，对其进行多元回归拟合分析，得到二次多项回归方程为:y=48.71-1.33×A+0.935 1×B+0.376 0×C+0.627 5×AB-0.308 8×AC+1.32×BC-2.92×A2-2.10×B2-1.33×C2，回归模型的方差分析数据见表3。

表2 响应面的设计及结果

表3 回归模型的方差及分析

通过表3 可以看出，模型P值为0.000 2（＜0.01），失拟项P值为0.398 6（＞0.05），R2=0.969 6，表明模型与实际情况的拟合程度比较好，能够用来预测在不同的变量条件下所对应的响应值以及可以用来分析和预测利用超声波辅助提取暖骨风多酚的工艺条件。该模型的变异系数为1.46%，在可接受范围内，说明模型的重复性很好[22]。根据P值，可以看出一次项A、B，二次项A2、B2、C2，交互项BC对暖骨风多酚提取量的结果影响差异极显著（P＜0.01）；一次项C，交互项AB、AC对暖骨风多酚提取量的结果影响差异不显著（P＞0.05）。根据F值可知，各个因素对暖骨风提取量影响的大小顺序为：料液比（A）＞超声时间（B）＞超声温度（C）。

2.3.2 响应面图和等高线图分析

如图6，分别反映了两两因素对暖骨风多酚提取量的影响。可以看出，A与B、A与C、B与C的响应面图陡峭且等高线形状接近椭圆形，说明它们相互之间作用较强；根据各因素相互之间的响应面及等高线的形状，可以看出它们与回归方程的方差分析结果相符合，说明通过Design Expert 11软件的Box-Behnken 设计法可以较好地反映出料液比、超声时间及超声温度3个因素对暖骨风多酚提取量的影响。

图6 不同因素之间相互作用的响应曲面图及等高线图

2.3.3 响应面验证试验

如表4 序号1 所示，经过响应面法优化的暖骨风多酚的提取工艺为表。根据实际情况和操作的方便，将其调整为序号2 所示，做3 次平行，与理论预测值误差为1.3%，说明该回归方程可以反映出暖骨风多酚提取量受到各个因素的影响及该模型有一定的分析能力，可以较好地预测暖骨风多酚实际提取量[23]。

2.4 暖骨风多酚提取的抗氧化能力试验结果

如图7，反映了暖骨风多酚的总抗氧化能力，同时可以看出样品浓度在0.3～0.8 mg/mL 时，随着浓度逐渐升高时，暖骨风多酚的总抗氧化能力也逐渐增强。以VC作为对照。当浓度升到0.8 mg/mL时，暖骨风多酚及VC 的总抗氧化能力也升到最大，分别为1.233、11.088 μmol/mL。由此可以看出VC 的总抗氧化能力大于暖骨风多酚的总抗氧化能力。

图7 暖骨风多酚和VC在不同浓度下的总抗氧化能力

2.5 暖骨风多酚的抗菌性试验结果

2.5.1 抑菌活性的测定

是否存在抑菌圈及抑菌圈的大小可以反映出样品是否具有抑菌作用及抑菌性的强弱，抑菌圈越大表明该样品的抑菌作用越好[24]。由表5 可知，暖骨风多酚对E.coli和SA均有一定的抑菌作用且对SA的抑菌效果比E.coli好，但形成的抑菌圈较小，抑菌效果不是很明显。

表5 E.coli、SA的抑菌圈大小（mm）

2.5.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定

由表6可以看出，暖骨风多酚对E.coli、SA的最低抑菌浓度均为50 mg/mL。说明暖骨风多酚抑菌作用不明显，也说明了抑菌作用越弱，最低抑菌浓度越高。

表6 不同菌种最低抑菌浓度（MIC）

3 结论

在单因素的基础上，选择乙醇作为提取暖骨风多酚的提取溶剂，利用超声辅助提取方法及响应面法优化暖骨风多酚提取量，得到最优提取工艺条件为：料液比1∶34、超声时间56 min、超声温度56 ℃，提取量为49.672 mg/g。同时，也对暖骨风多酚的总抗氧化能力、抑菌活性及最低抑菌浓度进行了初步的研究，发现暖骨风多酚具有一定的抗氧化活性，但在0.3～0.8 mg/mL浓度下，其总抗氧化能力小于VC。暖骨风多酚对E.coli、SA有一定的抑菌作用，但形成较小的抑菌圈，抑菌作用不明显且最低抑菌浓度均为50 mg/mL。