基于HPLC-Q-TOF-MS/MS和网络药理学探讨温肾宣痹汤治疗膝骨关节炎的作用机制*

孙家豪，夏天卫，朱家庆，李志鹏，王海平，沈计荣（南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种影响所有关节和关节周围组织的复杂疾病[1]。膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）的特征是关节软骨的进行性损伤，主要表现为关节软骨的退变、软骨下骨的改变、滑膜炎[2]。其发病原理为膝关节受力不均、大量的结构和代谢改变发生，最终软骨完全磨损，暴露软骨下骨[3-4]。膝骨关节炎的发病机制至少涉及机械因素、炎症和代谢[5]。这些因素相互影响，导致除晚期关节置换外，大多数治疗方法疗效不佳[6-7]。

中医学认为膝骨关节炎属于“膝痹”范畴。温肾宣痹汤由国家级名老中医诸方受教授创制[8]。江苏省中医院运用该方治疗膝骨关节炎有五十余年历史，疗效确切[9]。前期随机对照试验亦发现温肾宣痹汤治疗膝骨关节炎，可显著缓解患者的疼痛，促进患膝的功能恢复[10]。

高效液相-四极杆串联飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF-MS/MS）是一种高效液相色谱（HPLC）与飞行时间质谱（TOF-MS）联用技术，结合了HPLC的高分离效率和TOF-MS的高分析精度。HPLC-Q-TOF-MS/MS不仅在分离和鉴定中药有效成分方面有着重要的应用价值，而且还可以应用于中药复方的研究。HPLC-Q-TOF-MS/MS可以分离各种成分，通过与已知物质的对比，实现中药复方成分的鉴定和分析，从而为中药复方的研究提供数据支持[11-12]。

因此，为探究温肾宣痹汤的有效成分和其治疗膝骨关节炎作用机制，本研究采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术对肾宣痹汤水煎剂和浓煎剂中的具体成分进行鉴定，并利用网络药理学预测所鉴定成分的作用机制。

1 方 法

1.1 质谱定性分析

1.1.1 主要仪器 LC-20ADxr型快速液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；Triple Q-TOF 5600型高分辨质谱仪（美国AB Sciex公司）。

1.1.2 药物 温肾宣痹汤组成：桂枝、附子、天麻、狗脊、山萸肉、木香、泽泻、麸炒白术、甘草各10 g，茯苓12 g，薏苡仁15 g，细辛6 g。所有药材均由江苏省中医院中药房提供，均由江苏省中医院文红梅主任中药师鉴定为正品。

温肾宣痹汤水煎剂：将温肾宣痹汤药材按照上述处方比例配置，加10倍量水，水煎1次，过滤药渣，制成200 mL的温肾宣痹汤水煎剂。

温肾宣痹汤浓煎剂：另取一份（药材由江苏省中医院中药房提供）按同样方法处理后，冷凝浓缩至每毫升含温肾宣痹汤生药材1 g。

1.1.3 试剂 桂皮醛对照品（纯度为99.6%，批号：U29Y-VR3C）购自中国药品检定研究院；甲醇（质谱纯，批号：I763435504）购自德国Merck公司；甲酸（质谱纯，批号:73C1812PR）购自美国Sigma-Aldrich有限公司；水（纯净水）购自娃哈哈饮料有限公司。

1.1.4 供试品溶液制备 取温肾宣痹汤水煎剂或浓煎剂各1.0 mL，加甲醇4.0 mL，振摇，12000 r/min离心10 min（离心半径为11.6 cm），取上清液，即得。

1.1.5 对照品溶液的制备方法 取桂皮醛对照品适量，加甲醇配置成质量浓度为0.5074 mg/mL的溶液，即得。

1.1.6 高效液相色谱法优化色谱条件 采用高HPLC初步设置温肾宣痹汤水煎剂或浓煎液的色谱条件。色谱柱为ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μL）。甲醇为流动相A，0.1%甲酸水为流动相B，梯度洗脱。梯度洗脱条件，0～40 min：5%A～90%A；40～45 min：90%A。45～47 min：90%A～5%A；47～55 min：5%A。流速：1.0 mL/min。柱温为35 ℃。检测波长为254 nm。分析时间为55min；进样量为10 μL。

1.1.7 液相色谱-质谱联用法分析温肾宣痹汤中化学成分 采用HPLC-Q-TOF-MS/MS进一步对温肾宣痹汤水煎剂进行液质联用分析。质谱条件：电喷雾离子源（ESI），采用动态背景扣除（DBS）和触发信息关联采集模式（IDA）的方法，分别进行正离子模式、负离子模式采集；质量扫描范围50～1500 m/z。质谱参数见表1。

表1 质谱参数条件

1.2 网络药理学分析

1.2.1 温肾宣痹汤所含活性化合物筛选及潜在靶点的搜集 基于中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），分别以温肾宣痹汤组成中药名称为关键词，检索温肾宣痹汤中12味中药的全部化学成分。本研究以口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18作为活性化合物的筛选条件，并结合文献报道，综合考虑该成分的生物学效应、含量及研究热度等诸多方面的因素，对化学成分进行筛选，提取出TCMSP中具有较高活性的化合物。同时在TCMSP平台搜集与候选化合物相关的潜在靶点。

1.2.2 疾病靶点的确定 以“osteoarthritis”作为关键词在Gene Cards数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（http://www.omim.org/）、DisGeNET数据库（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/ menu/home）3个疾病相关数据库查询与膝骨关节炎相关的疾病靶点。

1.2.3 温肾宣痹汤-膝骨关节炎疾病交集靶点相互作用网络构建 将温肾宣痹汤的相关作用靶点和膝骨关节炎已知疾病靶点取交集，将交集靶点上传至STRING数据库（http：//string-db.org/）进行蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）网络的构建。

1.2.4 化合物-靶点-疾病网络的构建及关键基因的筛选 将筛选后的核心靶点上传至Cytoscape 3.2.1软件（https://cytoscape.org/）生成化合物-靶点-疾病网络图，以展现复方在系统水平上对疾病的作用。同时，运用Cytoscape 3.2.1软件进行基于拓扑参数的核心网络筛选。

1.2.5 基因本体（GO）功能富集分析和基因组百科全书（KEGG）功能富集分析 利用DAVID 6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对核心靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，将P＜0.05设定为GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果的基本筛选条件，进而通过OmicShare平台（http://www.omicshare.com/tools/home/report/koenrich.html）对富集分析结果进行可视化处理，以体现温肾宣痹汤治疗膝骨关节炎的主要作用通路。

2 结果

2.1 质谱定性分析

2.1.1 HPLC优化色谱条件 温肾宣痹汤水煎剂和温肾宣痹汤浓煎剂的色谱图见图1～2。温肾宣痹汤浓煎剂的样品色谱峰种类明显优于温肾宣痹汤水煎剂，故进一步将温肾宣痹汤水煎剂进行液质联用分析。

图1 温肾宣痹汤水煎剂的HPLC 色谱图 （254 nm）

图2 温肾宣痹汤浓煎剂的HPLC 色谱图 （254 nm）

图3中桂皮醛对照液（0.50740 mg/mL）中桂皮醛的保留时间为26.323 min。温肾宣痹汤水煎剂中检测到桂皮醛保留时间为26.329 min，但含量较低，按照外标法计算汤液中桂皮醛含量为0.00469 mg/mL。温肾宣痹汤浓煎剂中，在26.32 min处未检测桂皮醛的色谱峰，可能是因为桂皮醛在样品浓缩过程中挥发减失。

图3 桂皮醛对照品的色谱图 （254 nm）

2.1.2 液相色谱-质谱联用法分析温肾宣痹汤中化学成分 采用HPLC-Q-TOF-MS/MS进一步对温肾宣痹汤水煎剂进行液质联用分析，正离子模式和负离子模式下的液质联用的总离子流图见图4～5。

图4 温肾宣痹汤水煎剂的HPLC-Q-TOF-MS/MS 总离子流图 （正离子模式）

图5 温肾宣痹汤水煎剂的HPLC-Q-TOF-MS/MS 总离子流图 （负离子模式）

利用Peakview软件中XIC manager功能对温肾宣痹汤水煎剂中可能出现的已报道化合物进行匹配，并结合保留时间、分子量及二级特征碎片，对匹配到的化合物进行结构确证。对于未知化合物峰，根据其分子量信息，运用Formula Finder功能进行分子式的预测，通过查询中国知网（CNKI）、Scifinder等数据库搜索该分子式下可能的结构式。正、负离子模式下各化合物的名称、分子式、分子量、二级特征碎片等信息见表2～3。在正离子条件下可检出19个化合物，在负离子条件下可检出9个化合物。方中有1种成分归属于桂枝，即桂皮醛；有6个成分归属于甘草，包括芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草苷、异甘草苷、甘草酸、甘草素；有2种成分归属于天麻，即邻苯二甲酸二甲酯、獐牙菜苷；有2种成分属于细辛，即细辛脂素、左旋芝麻脂素；有3种成分归属于狗脊，即C-藜芦酰乙二醇、麦芽酚、香荚兰乙酮；有4种成分归属于附子，分别是苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、附子灵；有2种成分属山萸肉，即马钱苷、裂马钱子苷；有2种成分归属于木香，即异去氢木香内酯、土木香内酯；有1种成分归属于白术，即双白术内酯Ⅱ。方中泽泻、茯苓、薏苡仁等药味的成分在温肾宣痹汤液未检出。

表2 温肾宣痹汤水煎剂中化学成分HPLC-Q-TOF-MS/MS 分析结果 （正离子模式）

表3 温肾宣痹汤水煎剂中化学成分HPLC-Q-TOF-MS/MS 分析结果 （负离子模式）

2.2 网络药理学

2.2.1 靶点的筛选及PPI网络的构建 通过TCMSP搜集温肾宣痹汤中的化合物，以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，经去重后共得到181个化合物，并将其作为候选化合物。另外，在TCMSP平台上搜集、去重后得到候选化合物的162个相应靶点。

检索Genecards、OMIM、DisGeNET数据库共获得2307个靶点，其中Genecards数据库2139个靶点，OMIM数据库76个靶点，DisGeNET数据库92个靶点，去重后为2083个靶点。

与温肾宣痹汤相关作用交集靶点为71个。（见图6）将72个靶点上传至STRING数据库构建PPI图，网络节点代表靶点，线条代表靶点与靶点之间的相互作用。（见图7）

图6 温肾宣痹汤和膝骨关节炎共同靶点筛选韦恩图

图7 核心靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络图

2.2.2 化合物-靶点-疾病网络的构建 利用Cytoscape 3.2.1软件将72个靶点、181个化合物、温肾宣痹汤和膝骨关节炎构建化合物-靶点-疾病网络图。（见图8）平均自由度7.2，利用基于拓扑参数的核心网络筛选得到自由度大于平均自由度的核心靶点18个，排名前5的分别为DPP4、AR、PTGS2、PPARG、ESR1、NR3C1。温肾宣痹汤可通过多成分、多靶点治疗膝骨关节炎，体现了中药复方的特点。

图8 温肾宣痹汤化合物-靶点-疾病相互作用网络

2.2.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 共筛选得到76条生物过程（BP）富集结果、12条细胞组成（CC）富集结果及29条分子功能（MF）富集结果。（见图9～11）共筛选得到27条KEGG通路富集结果，排名前20的结果见图12。

图9 BP 富集结果

图10 CC 富集结果

图11 MF 富集结果

图12 温肾宣痹汤活性成分-潜在靶标的KEGG 通路富集分析

富集分析结果显示：炎症相关的信号通路主要富集在肿瘤坏死因子（TNF）相关信号通路、Toll样受体信号通路[TLRs/NF-κB（核因子κB）信号通路]、花生四烯酸代谢相关信号通路、NOD样受体信号通路中。其中PI3K/Akt信号通路与雌激素信号通路等密切相关。

3 讨论

3.1 膝骨关节炎发病机制 膝骨关节炎是最常见且可致残的关节病，主要表现为软骨破坏、滑膜炎症、软骨下骨囊变等[13]。

3.1.1 炎症微环境与软骨损伤 膝骨关节炎患者的滑膜及其周围组织中常见巨噬细胞浸润（即炎症微环境）进而加剧滑膜炎症与软骨损伤，如：血清与关节液中炎症因子[TNF-α、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6]表达水平升高，以及关节软骨内相关金属蛋白酶[基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、MMP-3、MMP-13、去整合素和金属蛋白酶-4（ADAMTS-4）、ADAMTS-5]表达水平升高[14-15]。IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子在膝骨关节炎中发挥了重要的致病作用[16]。其中IL-1β可通过激活NF-κB、细胞外调节蛋白激酶（ERK）-c-Jun氨基末端激酶（JNK）-蛋白激酶p38（p38）丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、TNF等信号通路加剧膝骨关节炎相关炎症，导致炎症反应下游蛋白酶表达增加，加速蛋白多糖和胶原降解，损伤关节软骨[17]。其中MAPK家族成员，包括p38 MAPK、JNK和ERK，在MMPs表达和随后的软骨破坏中发挥重要作用[18]。

软骨细胞合成代谢和分解代谢的不平衡是膝骨关节炎发病的潜在机制，这些机制与炎症密切相关[19]。IL-1β可在体外诱导软骨细胞分解代谢基因表达，通过促进软骨细胞中具有血栓反应蛋白基序的ADAMTS和MMP的表达，加快蛋白多糖与胶原的降解，损伤关节软骨[20]。

研究表明IL-1β介导了软骨细胞中MMPs的诱导[21]。因IL-1β主要受NF-κB调节，而NF-κB激活介导的软骨细胞保护作用与抑制MMP基因有关。NF-κB信号转导的调节可能与抑制IL-1β诱导的MMP基因家族在软骨细胞中的表达有关。MMP家族成员在正常生理过程中参与了细胞外基质（包括蛋白多糖和胶原）的分解，MMP-1和MMP-13参与了软骨细胞外基质的主要成分Ⅱ型胶原的降解。MMP-3可以帮助MMP-1和MMP-13降解Ⅱ型胶原，但膝骨关节炎患者MMP活性过高导致细胞外基质破坏过多。

3.1.2 血管异常增生 膝骨关节炎进展程度越大，其软骨下骨血液供应越丰富。由于骨的重塑、骨量丢失，退变部位被新生的毛细血管及神经纤维组织所填充，导致软骨下骨的血液供应丰富。正常关节软骨是一种非血管化的组织，对血管形成有阻力。这种特性是由于软骨内的高浓度抗血管生成因子导致的，如软骨调节素-1（CHM-1）和血栓反应素-1（TSP-1）。膝骨关节炎患者对关节血管入侵的抵抗力降低。血管生成因子和抗血管生成因子在膝骨关节炎软骨细胞中均高表达，而蛋白酶抑制剂在邻近骨板的软骨深层保持正常水平。这可能允许新生血管自下而上的侵袭。骨关节炎软骨血管生成可能重新启动软骨内骨化过程，从而导致软骨细胞外基质（ECM）矿化。同时，软骨下骨内血管由于异常应力导致的微骨折延伸至钙化软骨层，并最终穿过潮线进入无血管的软骨，同时伴随血管生成的感觉神经也进入关节软骨导致疼痛。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）已被证实能刺激膝骨关节炎软骨下骨血管和神经的生长，故血管生成和膝骨关节炎关节疼痛相关[22]。此外，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是一种在缺氧状态下发挥作用的核转录因子。当骨关节内出现缺氧情况时，HIF-1α转移入核，使得血管内皮生长因子（VEGF）表达增高导致血管增生，从而促进了滑膜炎症的浸润，并导致疼痛[23]。

3.2 温肾宣痹汤治疗膝骨关节炎的作用机制

3.2.1 抗炎 桂枝中桂皮醛可通过多种方式抑制膝骨关节炎的炎症反应[24-26]。（1）桂皮醛可抑制IL-1β诱导的NF-κB降解，并抑制p38 MPAK和JNK1/2的活化。这提示桂皮醛可能通过抑制IL-1β诱导的人膝骨关节炎软骨细胞炎症。（2）桂皮醛可抑制MAPKs的磷酸化和促炎基因而在脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞中发挥抗炎作用。（3）桂皮醛可通过抑制炎症状态下TLR4的寡聚而抑制TLR2、TLR4和髓样分化蛋白88（MyD88）mRNA的表达，下调环氧化酶2（COX-2）和干扰素-β（IFN-β）的表达。（4）桂皮醛还可通过硫代化PI3K或丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）中的半胱氨酸残基，对单核/巨噬细胞介导的免疫应答起到强烈的调节作用，从而抑制炎症。（5）桂皮醛可抑制IL-1β 诱导的软骨细胞MMP-1 mRNA、MMP-3 mRNA 和MMP-13mRNA表达，抑制滑膜成纤维细胞MMP-13的释放，从而抑制炎症。

天麻中獐牙菜苷抗炎症作用主要是通过激活SIRT1、抑制NF-κB通路、促进Forkhead转录因子（FOXO1）信号通路逆转炎症介质和促炎性细胞因子表达，以及促进转录因子和抗炎细胞因子的表达来发挥其抗炎作用[27]。

附子中苯甲酰乌头原碱（benzoylaconine，BAC）为单酯型生物碱，可以有效调节类风湿关节炎患者血清中的细胞因子IL-1β、TNF-α和VEGF，而且对滑膜中重组与合成蛋白（Nrf2）、血红素氧合酶（HO-1）和酮氧化还原酶1（NQO1）的表达有显著上调作用[28]，具有抗炎镇痛功效。

木香中异去氢木香内酯可通过抑制一类蛋白质（ASC）寡聚化的产生抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体的激活。而且异去氢木香内酯能显著抑制LPS介导的炎症小鼠模型中IL-1β分泌和腹腔中性粒细胞的招募[29]。

3.2.2 免疫调节作用 桂皮醛具有保护软骨的作用。桂皮醛可能通过抑制成纤维细胞、破骨细胞和骨髓间充质干细胞的增殖，促进成骨细胞增殖和增强骨重塑，从而改善骨组织的微观结构，提高其生物力学性能。研究表明成纤维细胞的异常增殖可促进细胞外基质的降解，损伤软骨细胞。高浓度的桂皮醛可明显抑制膝骨关节炎患者病变滑膜成纤维细胞的生长；低浓度桂皮醛可显著提高成骨细胞的碱性磷酸酶活性，并明显增强RUNX2、OCN和COL1A1的表达。这可能是通过下调NF-κB和激活T细胞核因子1（NFATC1）mRNA介导的[30]。

此外，聚合蛋白是软骨细胞外基质的主要成分，聚合蛋白的裂解可以由金属蛋白ADAMTS家族的几个成员完成。桂皮醛可通过抑制NF-κB和p38-JNK途径，显著抑制IL-1诱导的SW1353 细胞和人原代软骨细胞MMP-1 mRNA、MMP-3 mRNA、MMP-13 mRNA、ADAMTS-4 mRNA 和ADAMTS-5 mRNA的表达，但不影响细胞活力，提示桂皮醛可延缓膝骨关节炎的进展[31]。

獐牙菜苷具有衰减和抑制细胞凋亡的作用。体外实验[32]证明天麻中獐牙菜苷可激活mTORC1信号通路，上调骨髓间充质干细胞的表达，上调RUNX2、OSX和OCN的表达，从而诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。且其诱导成骨细胞分化的作用机制与抑制成骨细胞凋亡相关。獐牙菜苷能显著促进成骨细胞MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性和矿化，内质网拮抗剂和G蛋白偶联受体（GPR30），拮抗剂均能明显阻断獐牙菜苷诱导的ALP活性和雌激素受体-过氧化物酶（ER-α）、GPR30蛋白表达。而这种磷酸化作用既可以被p38拮抗剂完全阻断，又能被ER拮抗剂和GPR30拮抗剂明显阻断[33]。因此，獐牙菜苷可能是通过与细胞膜ER-α和GPR30相互作用，诱导p38磷酸化，激活p38信号通路对MC3T3-E1细胞发挥作用。

山茱萸中的活性成分马钱苷能抑制软骨细胞的焦亡和NF-κB信号通路的激活，而且马钱苷能抑制膝骨关节炎软骨退变，减少膝骨关节炎关节软骨中Col2的丢失，抑制MMP3、MMP13和半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）蛋白表达。

3.2.3 抗氧化 研究表明，膝骨关节炎患者软骨细胞和滑膜细胞线粒体功能障碍后产生大量NO和活性氧，可引起氧化损伤[34]。桂皮醛能够增加过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活性，抑制软骨细胞的氧化[35]。

3.2.4 抑制血管生成 甘草中甘草素和甘草苷均能抑制肿瘤血管新生，对白血病HL-60细胞增殖有较显著的抑制作用，且甘草素的活性强于甘草苷。甘草素抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡机制可能为：经磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/m TORp70S6激酶（PI3K/AKT/m TOR-p70S6K）信号通路，抑制HeLa细胞血管生成相关因子的表达，从而抑制HeLa细胞血管的生成[36]。异甘草苷能抑制内皮细胞（ECs）的增殖和迁移，抑制MMP-2的分泌，抑制VEGF的表达，从而抑制膝骨关节炎软骨下血管的改变[37]。而山茱萸中马钱苷能抑制膝骨关节炎骨重塑，减少软骨下骨中异常血管形成[38-39]。

4 小结

温肾宣痹汤可通过发挥抗炎、影响细胞增殖与凋亡、抗氧化及抑制血管生成的作用治疗膝骨关节炎。但本研究存在不足之处：一方面，方中泽泻、茯苓、薏苡仁等中药的成分在温肾宣痹汤未检出，且所析出的部分化合物针对膝骨关节炎的具体作用效果与机制不详，并无相关文献报道；另一方面，温肾宣痹汤中有效成分被人体吸收有限，具体入血有效成分也未详细测定，缺乏相关的动物及人体血清药理学实验。故后续研究拟进行动物及人体血清药理学实验，进一步挖掘温肾宣痹汤及其所含活性成分治疗膝骨关节炎的具体机制。