超高效液相色谱-串联质谱法快速测定挂面、方便面中15 种真菌毒素

许 嘉 王 硕 曹瀚文

（北京市朝阳区疾病预防控制中心， 北京 100025）

真菌毒素 （Mycotoxins） 是由某些真菌产生的化合物， 常见的真菌毒素包括黄曲霉毒素B1（AFB1）、 黄曲霉毒素B2（AFB2）、 黄曲霉毒素G1（AFG1）、 黄曲霉毒素G2（AFG2）、 雪腐镰刀菌烯醇 （NIV）、 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 （DON）、 3－乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3－AcDON）、 15－乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇 （15－AcDON）、 玉米赤霉烯酮 （ZEA）、 赭曲霉毒素A （OTA）、 伏马菌素B1（FB1）、 伏马菌素B2（FB2）、 伏马菌素B3（FB3）、 T－2 毒素和HT－2 毒素等。 这些毒素在食品安全领域引起了全球关注， 因为它们广泛存在于各种谷物及其制品中， 对人类和动物健康有显著影响。 据联合国粮食及农业组织估计， 全世界谷物供应链25%受到真菌毒素的污染， 对人体和动物的健康具有极大危害[1]。 小麦在生长时期容易受到镰刀菌、 青霉菌、 曲霉菌等致病菌的污染[2]。 侵染小麦的镰刀菌产生的DON、 ZEA、 T－2 和HT－2 这4 种镰刀菌毒素对小麦污染情况最为严重[3]。 另外，伏马菌素主要污染玉米、 小麦等粮食作物， 在大豆、 坚果中也有分布[4]。 基于小麦广泛被多种真菌毒素污染的背景， 本研究选择同时测定15 种污染严重、 风险较高的真菌毒素（AFB1、 AFB2、 AFG1、AFG2、 NIV、 DON、 3 －AcDON、 15 －AcDON、ZEA、 OTA、 FB1、 FB2、 FB3、 T－2 和HT－2 毒素）。

目前， 真菌毒素的检测方法包括酶联免疫法[5]、 荧光免疫分析法[6]、 薄层色谱法[7]等。 相较于上述测定方法， 超高效液相色谱－串联质谱法（UPLC－MS/MS） 可降低假阳性率、 改进分离不完全[8～9]的问题， 具有高通量、 操作简单、 快速灵敏、回收率高、 重复性好等特点。 UPLC－MS/MS 通过高度灵敏的质谱检测， 能够确保非常低的检出限，并准确鉴定微量的真菌毒素， 这对于评估食品（如谷物和挂面、 方便面） 中的低浓度真菌毒素至关重要[10]。 且因具有高通量的分析特性， 使UPLCMS/MS 可以同时检测多种真菌毒素， 极大地提高了样品处理的效率， 特别适用于大规模的食品安全监测[11]。 同时， 由于其高灵敏度和强大的分离能力， 采用UPLC－MS/MS 时允许使用更为简单的样品前处理步骤， 如简单的萃取和净化， 从而减少样品处理时间并降低成本[12]。

在我国， 谷物是居民膳食结构的核心成分， 尤其在北方， 小麦的种植和消费可以追溯到几千年前， 它与当地的历史、 文化和生活方式密不可分。在现代社会， 人们的生活节奏加快， 对方便食品的需求随之增加， 这使得像挂面和方便面这样的产品成为了消费热点。 这种转变也带来了食品安全上的新挑战。 真菌毒素， 特别是在存储不当的情况下，可能在谷物中滋生， 进而污染食品。 鉴于这种风险， 确保产品质量和安全性显得尤为重要。 为此，需要制定严格的检测标准和方法， 确保消费者能够放心食用。 本研究拟基于UPLC－MS/MS 开发一种针对挂面和方便面中多种真菌毒素的快速测定方法， 以期满足监管机构要求， 也为广大消费者健康提供有力技术保障。

一、 材料与方法

（一） 仪器与设备超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱仪 （ACQUITY UPLC I－Class/Xevo TQ－S， 美国Waters 公司）， 配有电喷雾离子源（ESI）； 电子天平（日本岛津公司）； 振荡器（德国Elma 公司）； 高速粉碎机（上海比朗仪器制造有限公司）； 漩涡混匀器 （德国IKA 公司）； 高速冷冻离心机（美国Sigma 公司）。

（二） 试剂乙腈、 甲醇（色谱纯， 美国Thermo Fisher Scientific 公司）； 甲酸（色谱纯， 美国Acros Organics 公司）。 乙腈－水－甲酸溶液（70∶29∶1，V∶V∶V）： 量取700 mL 乙腈加入290 mL 水中，加入10 mL 甲酸， 混匀。 0.1%甲酸甲醇溶液： 吸取1 mL 甲酸， 用甲醇稀释至1 L， 混匀。 0.1%甲酸水溶液： 吸取1 mL 甲酸， 用超纯水稀释至1 L，混匀。

（三） 标准物质与标准溶液

1.内标物质。13C20－OTA， 10.00 μg/mL；13C34－FB1， 5.04 μg/mL；13C34－FB2， 5.05 μg/mL；13C34－FB3， 10.02 μg/mL；13C17－AFB1， 0.500 μg/mL；13C17－AFB2， 0.500μg/mL；13C17－AFG1， 0.502μg/mL；13C17－AFG2， 0.502μg/mL；13C18－ZEA， 25.2 μg/mL；13C15－NIV， 25.30 μg/mL；13C15－DON， 10.0 μg/mL；13C17－3－AcDON， 25.3 μg/mL；13C22－HT－2， 10.1 μg/mL；13C22－T －2， 1.02 μg/mL。 以上均购自ROMER 公司。

2. 混合标准储备液。 吸取一定量的标准溶液，用甲醇定容至10 mL， 涡旋混匀， 在－20℃保存。

3.混合同位素内标标准储备液。 分别移取一定体积的15 种真菌毒素同位素标准溶液于5 mL 容量瓶中， 用乙腈稀释定容至刻度， 充分混匀后于－20℃避光保存。

4.标准曲线溶液。 准确移取混合标准储备液适量， 用超纯水逐级稀释， 配制成不同浓度点的混合标准曲线系列溶液。 分别准确移取10 μL 混合同位素内标标准储备液于各内插管中， 加入190 μL 对应的混合标准曲线浓度点溶液， 于涡旋混合器上混合均匀， 配制成标准曲线溶液系列。

（四） 仪器条件

1. 色谱条件。 色谱柱为Cortecs UPLC C18柱（150 mm×2.1 mm， 1.6 μm）。 流动相A 为0.1%甲酸水溶液， 流动相B 为0.1%甲酸甲醇溶液； 柱温为40℃； 样品室温度为10℃； 进样量为5 μL。 梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

2. 质谱条件。 离子源为ESI， 正离子模式； 质谱扫描方式为多反应监测模式（MRM）； 锥孔电压为3.0 kV； 加热气温度为400℃； 离子源温度为150℃； 脱溶剂气流速为800 L/h。 各目标化合物及其内标物的保留时间、 定性定量离子对及锥孔电压、 碰撞能量见表2。

表2 15 种目标化合物和14 种内标物质的质谱参数

（五） 样品处理

1.样品前处理。 用高速粉碎机将挂面、 方便面粉碎， 过筛， 使其粒径小于0.5～1 mm 孔径试验筛， 混合均匀后储存于样品瓶中， 密封保存， 置于－20℃低温冰箱中保存， 供检测用。

2. 提取与净化。 测试样品： 准确称取5 g （精确到0.01 g） 试样于50 mL 离心管中， 加入20 mL乙腈－水－甲酸溶液 （70∶29∶1，V∶V∶V）， 并用涡旋混合器混匀1 min， 置于旋转摇床上振荡提取30 min， 然后以8 000 r/min 离心5 min。 准确转移0.5 mL 上清液于1.5 mL 离心管中， 加入1.0 mL水， 旋涡混匀后， 在4℃下以10 000 r/min 离心10 min， 吸取上清液过0.22 μm 滤膜。 吸取190 μL 处理好的样品滤液于300 μL 内插管中， 加入10 μL稳定同位素混合溶液， 混匀， 待上机检测。

3.空白试验。 除不称取试样外， 均按上述步骤进行。

二、 结果与分析

（一） 色谱柱的选择考察比较了Cortecs UPLC C18（150 mm×2.1 mm， 1.6 μm）、 Capcell Pak C18（100 mm×2.1 mm，2 μm） 和Waters ACOUITY（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm） 3 种色谱柱对目标化合物的分离效果。 结果显示， 当采用Cortecs UPLC C18柱时， 目标化合物分离好， 峰形尖锐， 保留时间适中， 能满足定量检测要求。 因此， 最终选择Cortecs UPLC C18色谱柱 （150 mm×2.1 mm， 1.6 μm）。

（二） 色谱条件的优化UPLC－MS/MS 检测样品时， 流动相的组成与配比会影响目标化合物的离子化效率和色谱峰峰形。 基于目标化合物易溶于甲酸水溶液、 甲酸甲醇溶液等溶剂的特性， 本研究比较了0.1%甲酸水溶液－0.1%甲酸甲醇溶液及超纯水 （含0.1%氨水） －0.1%甲酸甲醇溶液等不同流动相体系下的分离效果。 结果显示， 水相中添加0.1%甲酸后， H+浓度增加， 使得正离子扫描模式下目标物的离子化效率提高； 同时甲醇溶液作有机相添加0.1%甲酸后， 可提高负离子的响应强度并改善峰形。 此外， 也有文献报道在ESI+模式下， 加入甲酸有利于提高目标物的离子化效率， 增大其灵敏度[13～14]。 因此， 综合考虑最终选择0.1%甲酸水溶液－0.1%甲酸甲醇溶液作为流动相体系， 并通过优化梯度洗脱 （结果见表1）， 使各目标化合物较好地分离， 色谱峰峰形良好。

（三） 质谱条件的优化配制15 种真菌毒素的混合标准溶液， 将标准溶液用独立针泵以5 μL/min 流速注入质谱， 在电喷雾离子源下， 进行一级母离子全扫描， 比较正、 负离子模式下的响应， 选择合适的模式， 优化质谱毛细管电压、 锥孔电压、 碰撞能量、 去簇电压、 雾化气、 气帘气， 检测得到具有最强响应的定量离子和定性离子对（见表2）。

（四） 提取溶剂的选择目前常用的提取溶剂主要为甲醇－水、 乙腈－水－甲酸、 乙腈－水等。在极性溶剂中加入一定比例的水后进行提取， 可提高其对样品的渗透性从而提高提取效率[15]。 本研究参考不同文献中的提取溶剂， 选取甲醇－水（70∶30，V∶V）、 乙腈－水－甲酸 （70∶29∶1，V∶V∶V）、 乙腈－水 （50∶50，V∶V） 进行对比，结果见图1。 结果显示， 乙腈－水－甲酸 （70∶29∶1，V∶V∶V） 作为提取溶剂时， 15 种目标化合物的回收率较甲醇－水（70∶30，V∶V） 条件下高； 而相较于乙腈－水（50∶50，V∶V） 作提取溶剂时， 虽然HT－2 的回收率有所下降， 但其下降幅度不超过3.5%， 且DON、 FB2、 FB3的回收率有了明显提高， DON 的回收率由74.0%提高到89.6%，FB2由75.8%提高到89.4%， FB3的回收率由69.7%提高到84.9%。 加入甲酸不仅有助于维持DON、FB2、 FB3的稳定性， 避免在萃取和分析阶段的降解， 而且它优化了ESI 的离子产生过程， 从而增强了检测的灵敏度。 因此， 本研究最终选择乙腈－水－甲酸 （70∶29∶1，V∶V∶V） 作为提取溶剂。这与谢慧英等[16]研究选用的提取溶剂相同， 但体积比略有不同。

（五） 线性关系、 方法检出限与定量限目标化合物使用同位素内标， 以空白样品的提取液作为标准溶液的稀释液， 配制基质匹配系列工作曲线。以待测物的质量浓度（μg/L） 为横坐标， 目标化合物的峰面积为纵坐标制作标准曲线。 结果显示， 15种真菌毒素在一定浓度范围内线性关系良好， 相关系数大于0.99 （见表3）。 以3 倍信噪比（S／N＝3）和10 倍信噪比 （S／N＝10） 时相应的加标量为方法的检出限（LOD） 和定量限（LOQ）， 结果显示，方法LOD 为0.1～33.0 μg/kg， 方法LOQ 为0.2～100.0 μg/kg。 方法的灵敏度完全满足国家标准对真菌毒素的限量要求。

表3 15 种真菌毒素的线性范围、 回归方程、 相关系数、 检出限和定量限

（六） 准确度与精密度对样品进行3 个浓度水平的加标回收试验， 每个浓度水平进行6 次重复实验， 计算测定结果的相对标准偏差 （RSD）。 结果显示， 15 种真菌毒素的平均回收率为76.9%～110.4%， RSD 为0.1%～7.1%（见表4）。 方法准确性高， 稳定性好， 符合GB/T 27404－2008 《实验室质量控制规范 食品理化检测》 对实验室质量控制范围的要求。

表4 15 种真菌毒素在挂面、 方便面中的回收率与精密度 （n＝6）

三、 结论

在食品安全领域， 真菌毒素的检测是一个十分重要的研究课题。 面对真菌毒素的结构多样性， 研究人员们必须不断革新和优化检测方法。 该研究践行了这一理念， 构建了一种挂面、 方便面中15 种真菌毒素的超高效液相色谱－串联质谱检测方法。该 方法利用MRM 模式， 确保了对各类真菌毒素的高灵敏度检测， 使得即便是微量的毒素也能被准确捕捉和分析。 此外， 该方法能够同时进行真菌毒素的定性和定量分析， 具有极高的应用价值和应用前景， 为食品安全领域提供了一种新的、 可靠的检测手段。