CYB561D2基因在神经胶质瘤组织中的表达及临床意义

黄纯， 周和平， 查正江， 朱克帅， 宣兰兰， 刘雅玲

神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，具体的发病机制仍不清楚，预后不佳，尤其高级别恶性胶质瘤［1，2］。本课题组前期通过对TCGA、GSE及REMBRANDT 3个基因数据库进行统计学生物信息技术分析，发现细胞色素B561家族成员D2（Cytochrome B561 family member D2，CYB561D2）基因过表达与胶质瘤生存期可能有一定关系。CYB561D2是一种重要的编码基因，在人体染色体的3p.21.3的630kb区域，参与体内氧化还原、电子转移、生化代谢，维持抗坏血酸的平衡［3］。本课题组前期细胞培养实验发现，CYB561D2基因的过表达可诱导免疫抑制，促进胶质瘤细胞的增殖、迁移［4］。因此，本研究纳入2018年10月―2022年12月在安庆市立医院神经外科接受治疗的78例神经胶质瘤患者资料，选取手术切除的胶质瘤组织和对应的瘤旁正常脑组织对照分析，寻找胶质瘤细胞凋亡、迁移等基因分析，从分子学角度寻找胶质瘤靶向治疗新思路，对神经胶质瘤病理组织中的CYB561D2基因的表达做进一步探讨和验证。

1 资料与方法

1.1 临床病例及组织标本取材 选取2018年10月―2022年12月安庆市立医院医院神经外科接受治疗的78例神经胶质瘤患者资料，包括36例男性与42例女性，年龄均在28~75岁范围内，平均年龄为（41.5±3.6）岁，所有病例术后病理证实为神经胶质瘤，患者术前均未经任何相关的肿瘤治疗，并进行定期随访。收集神经胶质瘤组织标本78例，为实验组。肿瘤手术路径过程中必须切除的正常脑组织标本32例，设为对照组。所有肿瘤标本均从肿瘤非坏死区收集，快速冷冻保存于-80 ℃冰箱中。采用荧光实时定量PCR实验（Real-time PCR）与免疫组织化学染色（S-P）研究分别检测实验组及对照组中CYB561D2基因的mRNA及蛋白的表达水平。本研究通过医院医学伦理委员会审批。

1.2 免疫组织化学染色 使用10%中性福尔马林对组织标本进行固定，并用常规石蜡进行包埋，制备4 μm厚的切片。免疫组织化学采用S-P法检测实验组与对照组组织病理中CYB561D2基因的蛋白表达，用磷酸盐缓冲液（PBS）对一抗进行替代进行阴性对照。兔抗人CYB561D2多克隆抗体与S-P免疫组化试剂盒都产自上海迈克生物科技有限公司，是美国Abcam 公司产品。将组织切片在4 ℃下与CYB561D2兔多克隆抗体培养过夜后在室温下进行染色实验；使用二级抗体生物素化牛抗鼠血清IgG（常州志远生物技术有限公司）在37 ℃下孵育30 min，再冲洗、复染、脱水、透明及封片。

1.3 免疫组化结果判定CYB561D2基因在组织中的蛋白表达由2名高年资病理医生进行阅片和评分，取平均值。参照半定量积分法，按照阳性反应强弱与阳性细胞占比打分。其中前者按照无色、淡黄、棕黄和棕褐分别对应0~3分；着色阳性面积按无着色、着色0%~30%、30%~60%、60%~100%分别打0、l、2、3分。两项打分之和判断其结果：0分为（-），1~2分为（+），3~4分为（⧺），5~6分为（⧻）。

1.4 荧光实时定量PCR（real-time PCR） 将78例实验组和32例对照组新鲜组织标本进行RNA逆转聚合酶链反应实验。运用Trizol试剂（Sigma公司，美国）从提取组织细胞里面的总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳对RNA纯度进行鉴定符合纯度要求。使用TriZol逆转录试剂盒（Sigma公司，美国）建立反转录反应体系，逆转录合成cDNA。在NCBI GeneBank中查找胶质瘤相关的CYB561D2引物信息。通过Primer v7.0引物软件完成设计工序。运用美国应用生物系统公司（ABI）的SYBR Green Master Mix展开荧光实时定量PCR实验对CYB561D2基因的表达进行评价。

1.5 统计学分析 通过SPSS 20.0软件完成数据的分析处理，计量数据执行正态性检验，符合正态性分布的数据用（）表示，计数资料采用卡方检验进行两组间比较（必要时辅以精确概率Fisher法计算P值）并记录χ2值；符合正态分布的计量资料采用t检验进行两组间比较，记录t值；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后常规病理结果 按照2021年第5版WHO中枢神经系统肿瘤分类临床指南对标本病理进行分级统计，其中12例为Ⅰ级，15例为Ⅱ级，19例为Ⅲ级，32例为Ⅳ级。Ⅲ、 Ⅳ级属于高级别胶质瘤，共有51例；Ⅰ级与Ⅱ级属于低级别胶质瘤，共27例。

2.2 胶质瘤组织和肿瘤周围正常脑组织中CYB561D2蛋白免疫组化的表达情况CYB561D2在各种类型胶质瘤中都有不同程度的表达，大部分定位于细胞浆内，尤以近核旁区明显，呈棕黄色或棕褐色颗粒，少部分位于胞核内。实验组中，高级别胶质瘤组CYB561D2蛋白呈高表达，低级别胶质瘤组中CYB561D2蛋白呈中低表达。对照组瘤旁组织中CYB561D2蛋白基本不表达。按免疫组化评分，高级别胶质瘤组中CYB561D2蛋白表达值为（4.86±0.32）；低级别胶质瘤组中CYB561D2蛋白表达值为（2.16±0.13），对照组中CYB561D2蛋白表达值为（0.53±0.12），各组间有统计学差异（P<0.05）（见表1、图1）。

图1 不同组织HE病理染色结果

表1 实验组、对照组CYB561D2蛋白免疫组化表达情况

2.3 Real-time PCR 检测胶质瘤组织（实验组）与正常脑组织（对照组）中CYB561D2基因mRNA的转录情况 利用RT-PCR技术对组织标本里面CYB561D2基因转录mRNA相对表达量进行检测，结果显示各组表达水平不一致，高级别胶质瘤组里面mRNA的表达量为（0.736±0.032），低级别胶质瘤组里面mRNA的表达量为（0.428±0.045）；对照组正常脑组织中基因转录mRNA表达量为（0.152±0.028）。差异具有统计学意义（χ2=2.75，P<0.05）（见图2）。

图2 各组组织中CYB561D2基因mRNA的转录水平（）

3 讨论

神经胶质瘤在中枢神经系统的原发性恶性肿瘤中较为多见，详细的发病机制仍不能明确，目前以手术切除联合放疗、化疗方法的临床疗效虽有一定提高，但患者预后仍然不够理想，平均生存时间仅有12~15个月［5］，新版中枢神经系统肿瘤分级标准在组织学特征的基础上增加分子参数，新版肿瘤分类为临床诊疗设定了新标准，分子检测不仅可以明确诊断，还可以进行分子分型、评估患者预后和预测患者肿瘤复发［6］。因此，需要从分子学角度进行深入研究，研究神经胶质瘤发病的病理生理机制，从而为胶质瘤患者治疗提供新的思路及方法。

CYB561D2基因是细胞色素B在选择性剪切后属于其中一种亚型，在人染色体3p.21.3的630kb区域，其表达蛋白定位于线粒体外膜，是一种分子质量为28kDa的疏水蛋白由6个α跨膜螺旋和4个内螺旋构成，这种较小且普遍存在的蛋白质作为电子转移成分广泛地参与了许多不同组织细胞的氧化还原、生长发育及生化代谢等［3］。研究表明，CYB561D2基因在调控多种肿瘤生长分化、浸润、侵袭等过程中扮演了较为重要的促进作用［7-9］。在黑色素瘤中，CYB561D2基因异常表达可促进癌细胞增殖、迁移与侵袭［10］。对肝细胞癌患者，CYB561D2的表达与其生存期之间存在负相关的关系，可成为判断肝癌预后的评价指标［11］。对于乳腺癌患者，CYB561D2基因mRNA过表达与ERBB2/HER2与浸润性CD4+T细胞存在关联，CYB561D2过度表达患者的总生存率显著降低，死亡风险增加［12，13］。

本课题组前期使用统计学生物信息学技术，通过对TCGA、GSE112及REMBRANDT 3个基因数据库CYB561D2基因表达与胶质瘤生存期分析发现，基因表达量越高患者肿瘤级别越高，预后越差，整体生存期也较短，CYB561D2基因在胶质瘤发生中扮演着致癌基因的作用。Tao等研究发现，在神经胶质瘤细胞系中，CYB561D2及其功能产物抗坏血酸盐剂量依赖性激活STAT3蛋白磷酸化，并过表达增加了PD-L1，诱导免疫抑制［14］。Ruby等对胶质母细胞瘤细胞系进行测序，发现CYB561D2多个基因融合，提示CYB561D2基因可能参与胶质瘤的发生、分化和进展［15，16］。

本文研究证实，胶质瘤细胞株敲除CYB561D2基因的表达，结果表明胶质瘤细胞的克隆和增殖均明显减弱，这符合前期有关的研究结果［17，18］。本次实验中，我们利用免疫组化与RT-PCR对CYB561D2基因在神经胶质瘤中的蛋白与mRNA表达水平进行检测并分析，CYB561D2在各种类型胶质瘤中都有不同程度的表达，大部分定位于细胞浆内，尤以近核旁区明显，呈棕黄色或棕褐色颗粒，少部分位于胞核内。实验组中，高级别胶质瘤组CYB561D2蛋白呈高表达，低级别胶质瘤组中CYB561D2蛋白呈中低表达，对照组瘤旁组织中CYB561D2蛋白基本不表达。神经胶质瘤中CYB561D2基因在蛋白和mRNA水平都有较高程度的表达，尤其在高级别恶性脑胶质瘤中，与对照组组织中CYB561D2基因表达相比有统计学差异（P<0.05）。本研究认为CYB561D2上调与胶质瘤的分级及恶性程度有一定相关，随着肿瘤级别的升高，CYB561D2表达的上调趋势越明显，进一步证实CYB561D2基因在胶质瘤形成、发展中有较大的促进作用。

同时本研究利用RT-PCR对组织里面CYB561D2基因转录mRNA相对表达量进行检测，结果显示各组表达水平不一致，高级别胶质瘤组里面mRNA的表达量明显高于对照组，因而，在临床诊疗方面，CYB561D2基因利于明确胶质瘤的诊断，进一步完成分子分型、评估患者预后和预测患者肿瘤复发［19，20］；靶向抑制CYB561D2基因的表达可能是治疗胶质瘤的一种新途径，CYB561D2基因在胶质瘤细胞生成中发挥促进作用，抑制CYB561D2基因表达从而起到抑制胶质瘤细胞增殖、迁移［21］。

神经胶质瘤的发生、发展是多基因、多种信号通路共同调控的结果。CYB561D2基因在神经胶质瘤中呈过表达，极有可能参与了胶质瘤的形成和进展，与神经胶质瘤患者预后有一定相关性。结合前期研究结果，目前可能与CYB561D2上调激活STAT3诱导胶质瘤的免疫抑制相关，其具体调控机制仍需进一步研究证实。CYB561D2基因目前在神经胶质瘤中初步证实为癌基因，可被当作神经胶质瘤的潜在靶点用于治疗中，给神经胶质瘤患者的临床治疗提供新依据和思路，当然这些还需要我们后期的进一步研究。

伦理学声明：本研究方案经由安庆市立医院伦理委员会审批［医学伦理（2022）第73号］，患者或授权家属均签署知情同意书。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：黄纯负责设计论文框架、起草论文、论文修改；朱克帅、刘雅玲负责数据收集、统计学分析、绘制图表；周和平、查正江、宣兰兰负责拟定写作思路、指导撰写论文并最后定稿。