白芨多糖对大鼠跨区皮瓣choke 区的影响

乐钦， 陈荣丽， 熊婧熙， 王婷怡， 蔡志恒， 易秋实， 曾心怡*

长江大学医学部，湖北 荆州 434023

我国每年因烧伤、肿瘤切除、糖尿病足、褥疮等造成皮肤软组织缺损的患者众多，目前穿支皮瓣移植以切取后对供区损伤小、受区修复功能及外形良好、设计灵活、应用方便等优点成为临床治疗这些患者常用的外科手段，但术后常因血循环障碍出现血管危象或感染导致皮瓣部分或全部坏死，其中主要原因之一是choke 区新生血管减少和供血不足[1]，如何促进choke区血管新生和保证皮瓣远端持续有效血供，防治皮瓣坏死，提高皮瓣存活率，成为临床讨论的热点[2,3]。中药在防治皮瓣坏死方面早有研究，有单体也有方剂，具有副作用小、靶点多、来源广且易得等优势，引起诸多学者的关注[4]。白芨多糖是中药白芨的主要药用成分，现代药理研究表明白芨多糖对消化、免疫和血液系统疾病有疗效[5]，表现为抗菌、抗炎、促创面愈合和抗肿瘤作用。白芨多糖能提高机体的抗氧化能力和自由基清除能力保护胃黏膜组织[6]；白芨多糖能抑制NLRP3 炎症小体过度活化促进糖尿病足溃疡创面愈合[7]；近期研究发现白芨多糖不仅促进血小板聚集，发挥止血和抗炎作用[8]，还能促进血管内皮生长因子表达，对血管生成有积极作用[9,10]，但目前未见白芨多糖对皮瓣作用的相关研究。因此，本研究通过构建大鼠背部穿支皮瓣模型，分析白芨多糖对跨区带蒂皮瓣choke 区血管新生和皮瓣远端供血的影响，探讨白芨多糖对穿支皮瓣的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级（SPF）SD 雄性大鼠，体重210～230 g，购自三峡大学动物中心，许可证号：SCXK（鄂）2022-0012，在标准化动物房中饲养。

1.1.2 实验药物与试剂 白芨多糖（纯度≥99%，批号ZLSW211123-3，西安泽朗生物科技有限公司）；RIPA裂解液、ECL 蛋白发光试剂（美仑生物科技有限公司）；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒和BCA 蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；小鼠抗VEGF、小鼠抗GAPDH 抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.1.3 主要仪器与设备 医用低温保存箱（青岛海尔生物医疗股份有限公司）、高速冷冻离心机（赛默飞世尔仪器有限公司）、酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司）、正置荧光显微镜（德国Leica 公司）及凝胶成像系统（贝徕美生物科技有限公司）等。

1.2 研究方法

1.2.1 动物模型制作 选取大鼠背部3 组动脉血管体：右侧胸背血管体、右侧肋间后血管体、右侧髂腰血管体，右侧肋间后血管体与右侧髂腰血管体之间的吻合区为choke1 区，右侧胸背血管体与右侧肋间后血管体之间的吻合区为choke2 区。参考文献建立大鼠背部穿支皮瓣模型，予1%戊巴比妥钠（40 mg/㎏）腹腔注射麻醉，背部除毛，用记号笔在大鼠两耳中点及尾骨间连一条将大鼠分为左右对称的直线，背部右侧设计9 cm×3 cm 的矩形框，上达肩胛骨下0.5 cm，下至髂嵴下1 cm，沿矩形框切开至深筋膜，分离皮下组织，包含胸背动脉、肋间后动脉、髂腰动脉和两个choke 区，结扎胸背动脉和肋间后动脉，保留髂腰动脉。掀起皮瓣，彻底止血后原位缝合，碘伏消毒切口[11](图1)。为减少实验误差，造模由同一位操作者完成。大鼠单笼饲养，自由饮食。

图1 皮瓣切取过程A：设计皮瓣 B：制作皮瓣 1、2、3、4、5 分别代表胸背血管体、choke2 区、肋间后血管体、choke1 区和髂腰血管体C：皮瓣缝合术毕Fig.1 The removal process of flap. A: Preoperative design of the flap; B:1. 2, 3, 4, and 5 represent the thoracic dorsal vascular body (TDAV), choke-2 region, intercostal posterior intercostal vascular body(PIAV), choke1 region, and iliac lumbar vascular body (ILAV); C:The flap was sutured postoperatively.

1.2.2 动物分组及给药 按随机数字表分为对照组和给药组，每组16 只。术后，给药组腹腔注射白芨多糖生理盐水溶液（250 mg/kg），对照组给予等体积生理盐水，1 d/次，持续7 d。

1.2.3 观察皮瓣成活情况 术后1～7 d，每天观察并记录皮瓣存活情况（毛发、颜色、质地、坏死面积等）[12]。术后7 d，各组大鼠在麻醉状态用数码相机拍照，Image-J 软件分析皮瓣总面积和成活面积。皮瓣成活率=（皮瓣成活面积/皮瓣总面积）×100%。

1.2.4 血管造影 术后7 d，大鼠麻醉仰卧位固定，钝性分离一侧颈动脉，24 号留置导管插入颈动脉，排尽体内血液，肝素生理盐水冲洗，5%明胶氧化铅缓慢、匀速注入颈动脉，至大鼠巩膜和四肢末梢呈橙红色停止灌注，放入-20 ℃冰箱24 h，待造影剂凝固后获取皮瓣。用X 线摄影成像装置对其进行拍片[3]，Photoshop CS 6 软件处理图片并对比分析。

1.2.5 HE 染色观察皮瓣血管 术后7 d，取大鼠choke区全层皮瓣组织1.0 cm×0.5 cm，4%多聚甲醛固定后行常规石蜡包埋，切片，厚4 μm，进行HE 染色。先分别在低倍镜（100×）下找出3 个微血管比较密集和动脉内径最大的区域，换至高倍镜（200×）下计数微血管数目和测量动脉内径，取平均值。采用双盲法计数，计数结果相差10%以上者重新计算[13]。

1.2.6 Western blot 检测VEGF 蛋白 术后7 d，取大鼠choke 区全层皮瓣组织1.0 cm×0.5 cm 提取样本总蛋白，测定蛋白浓度并调整上样量为40 μg，经12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿法转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭后，加小鼠抗大鼠VEGF（1：2000）于4 ℃孵育过夜，加入二抗（1：5000）室温孵育1 h，经TBST 洗涤30 min 后用凝胶成像系统显影，Image-J 软件对特异性条带进行灰度扫描分析，目的蛋白条带与GAPDH 灰度的比值为VEGF 蛋白的相对表达量[13]。

1.3 数据处理

所有数据采用Graph Pad Prism 8 软件进行统计学处理，正态分布的计量数据以（±s）表示；运用t检验进行比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 皮瓣成活率

大鼠全部成活。术后7 d，对照组和给药组皮瓣远端出现不同程度的坏死，坏死区域质地偏硬，结痂，呈黑褐色。皮瓣成活率给药组为（86.1±1.4）%，对照组为（61.3±4.0）%，给药组高于对照组，具有显著性差异（P＜0.0001，图2）。

图2 术后7 d 皮瓣成活率（n=8）A：对照组（上）和给药组（下）皮瓣存活情况B：皮瓣存活率统计图(**** P＜0.0001)Fig.2 The survival rate of the flap at day 7 after operation (n=8). A: Survival of flap in control and treatment groups; B:Statistical chart of survival rate of the flap (****P＜0.0001）.

2.2 明胶-氧化铅血管造影

术后7 d，皮瓣血管观察及血管造影结果显示：相较于对照组choke 区血管稀疏、结构紊乱，给药组choke 区血管丰富且血管结构清晰（图3A、B）；髂腰动脉 直 径 给 药 组 为（681.60±35.48）μm，对 照 组 为（446.98±21.61）μm，两组具有显著性差异（P＜0.0001，图3C）；图3D 表明肋间后血管体与髂腰血管体之间的距离（Ⅱ-Ⅰ）给药组长于对照组，（4.27±0.17）vs（3.46±0.40）cm，P＜0.001；胸背血管体与肋间后血管体之间的距离（Ⅲ-Ⅱ）两组没有统计学差异，（2.23±0.16）vs（1.95±0.41）cm；血管向皮瓣远端延伸的距离即胸背血管体与髂腰血管体之间的距离（Ⅲ-Ⅰ）给药组明显优于对照组，（6.50±0.33）vs（5.41±0.38）cm，P＜0.0001。

图3 术后7 d 皮瓣血管生成情况（n=8）A：皮瓣血管肉眼观B：明胶-氧化铅造影1、2、3、4 分别代表肋间后血管体、choke2 区、髂腰血管体和动脉直径测量位置 C：髂腰血管体血管直径统计图（μm）D：皮瓣血供距离统计图 II-I 为肋间后血管体与髂腰血管体之间距离Ⅲ-Ⅱ为胸背血管体与肋间后血管体之间距离Ⅲ-Ⅰ为胸背血管体与髂腰血管体之间距离Fig.3 Angiogenesis of the skin flap day 7 after surgery and (n=8). A: Vascular condition of the flap 7 days after operation; B: Gelatin lead oxide angiography 1, 2, 3, and 4 represent PIAV, choke2, ILAV, and arterial diameter measurement locations; C: Statistical chart of ILAV diameter (μm); D: Statistical chart of distances of II-I, Ⅲ-Ⅱ, Ⅲ-Ⅰ(III, the distance between the PIAV and ILAV; Ⅲ-Ⅱ, the distance between the TDAV and PIAV; Ⅲ-Ⅰ, the distance between the TDAV and ILAV).

2.3 微血管密度

术后7 d，大鼠皮瓣HE 染色观察choke 区微血管数目，对照组为（6.7±1.3）个，给药组为（11.8±1.5）个，给药组微血管数目明显多于对照组，差异有统计学意义（P＜0.0001，图4）。choke 区 动 脉 内 径 给 药 组 为（60.14±6.99）μm，对照组为（28.01±5.07）μm，差异有统计学意义（P＜0.0001），见图5。

图4 术后7 d 大鼠choke 区微血管数目（HE 染色, n=8）A：对照组B：给药组C：两组皮瓣微血管数目统计图(**** P＜0.0001)Fig.4 The microvascular number of the choke area at day 7 after operation（n=8）. A: Control group; B:Treatment group; C:Statistical chart of microvascular number of the flap in the two groups(****P＜0.0001）.

图5 术后7 d 大鼠choke 区动脉内径（HE 染色, n=8）A：对照组B：给药组C：两组choke 区动脉内径统计图(**** P＜0.0001)Fig.5 The intraluminal diameter of the choke artery day 7 after operation (n=8). A:Control group; B:Treatment group; C:The intraluminal diameter of the choke artery in the two groups (****P＜0.0001）.

2.4 VEGF 蛋白表达

术后7 d，相较于对照组，给药组皮瓣choke 区VEGF 蛋白表达水平更高，差异有统计学意义（P＜0.0001，图6）。

图6 两组choke 区皮瓣VEGF 表达水平Western blot 检测（A）及统计图（B）A：两组皮瓣VEGF 蛋白Western blot 条带 B：VEGF 蛋白表达含量统计图(**** P＜0.0001)Fig.6 The VEGF expression levels in flap of choke area in the two groups. A: protein bands of VEGF protein of the flap in the two groups; B: Statistical analysis of VEGF protein level (****P＜0.0001).

3 讨论

现代医学研究发现跨区穿支皮瓣坏死常见原因是在潜在供区发生缺血，这与中医学的“血瘀”病症有相似之处。中药可通过抗氧化应激、抑制细胞凋亡及促进血管再生等途径防治皮瓣坏死，白芨多糖因收敛止血、消肿生肌的作用常作为临床创面治疗药[5]。付瑞娟[6]研究发现白芨多糖能增加胃溃疡模型小鼠体内VEGF 的表达量，证实白芨多糖通过促进血管生成改善溃疡区的血供状况，加速创面微循环，使受损的胃黏膜组织重建，进而加速胃溃疡创面愈合。颜文斌等[10]研究白芨多糖对围绝经期大鼠卵巢的影响发现，白芨多糖能刺激衰老卵巢中VEGF 蛋白高表达，增加血管数量，促进血管生成，从而促进子宫功能恢复。这些研究结果提示白芨多糖可能是潜在的防治皮瓣坏死的药物。

皮瓣成活的根本是具有持续的血供，而血管形成和血管生成是皮瓣血运重建的关键[14]。皮瓣移植后因创面低氧环境诱导高表达的VEGF 特异性地与血管内皮生长因子受体2（VEGF-2）结合，使活化的血管内皮细胞增殖，进而激活促进血管新生的各种信号通路，加速微血管的通透性及调整血管密度，达到血管新生的目的[15～17]，从而促进皮瓣成活。本研究发现，术后经白芨多糖治疗，皮瓣成活率为86.1%，其坏死区域主要位于右侧胸背血管体区；对照组皮瓣成活率为61.3%，其坏死区域主要位于右侧胸背和右侧肋间后血管体区（图2）。相较于对照组，给药组皮瓣成活率显著提高。明胶-氧化铅血管造影结合HE 染色结果发现，给药组choke 区血管结构清晰且微血管丰富（图3B、图4）。进一步研究发现，与对照组相比，白芨多糖治疗后大鼠皮瓣choke 区VEGF 蛋白表达水平显著增加，可见白芨多糖能通过VEGF 蛋白高表达，促进血管生成，从而提高皮瓣的成活率。

有研究发现皮瓣血供的距离也是影响血供的关键，血供距离越短，则皮瓣更容易因缺血发生坏死[14]。

本研究对血管造影进行分析，对照组血管向皮瓣远端延伸为5.41 cm，给药组血管向皮瓣远端延伸达6.50 cm，具有显著性差异，且主要是增加了髂腰血管体到肋间后血管体Ⅱ-Ⅰ之间的距离，（4.27±0.17）vs（3.46±0.40）cm，P＜0.001，而胸背血管体到肋间后血管体Ⅲ-Ⅱ之间的距离增长没有统计学意义（图3D）；此外，给药组髂腰动脉直径扩张明显，（681.60±35.48）vs（446.98±21.61）μm（图3C），choke 动脉扩张显著，（60.14±6.99）vs（28.01±5.07）μm，P＜0.0001，（图5），故认为白芨多糖具有促进血管向缺血区延伸以及扩张血管的作用，增加潜在区域的血供以促进皮瓣成活。本研究首次证实白芨多糖能提高皮瓣成活率，但白芨多糖作用的最适剂量和可能的分子信号通路有待更为深入、系统的研究，且本研究是动物实验，需要在临床上对人皮瓣移植进一步探索。