米草精酿啤酒酿造工艺优化及其品质分析

付奕婷，崔云前*，张增浩，尹泽淼

（齐鲁工业大学（山东省科学院）中德啤酒技术中心，山东 济南 250300）

相对于传统的工业啤酒而言，精酿啤酒是新型啤酒的一种，有个性突出、风味多样等特点，并具有很强的市场竞争力和广阔的发展空间[1]。然而，过量饮用啤酒会使尿酸产生过多或排泄不足导致血清尿酸水平升高，进而诱发高尿酸血症（hyperuricemia，HUA），这与黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活性增加直接相关，XOD在嘌呤代谢过程中能催化次黄嘌呤生成黄嘌呤并进一步生成尿酸，抑制其活性能阻止黄嘌呤向尿酸转化。

米草，学名互花米草（Spartina alternifloraLoisel.）是禾本科米草属多年生草本植物，多生长于滨海盐沼中潮带上部至高潮带，其还富含黄酮、多糖、皂苷及其他生物活性物质及必需微量元素，米草提取物中的异戊基奎尼酸、香豆酸和苜蓿素具有抗菌、抗炎、保肝利胆、降血脂、抗氧化、抗痛风、消除自由基等功效，总黄酮具有增强抵抗力的作用[3-4]。YANG Y S等[5]研究表明，由阿魏酸和互花米草合成的化合物有抑制XOD活性和降低尿酸水平的作用。不少学者对互花米草的活性成分及其保健作用进行研究，使其在啤酒中的应用也成为一种可能[6]。钦佩等[7]以互花米草提取液和35度白酒为原料制成的露酒，风味宜人兼有抗痛风、助睡眠和醒酒等功效。陈琳[8]以大麦芽、小麦芽、米草提取液和沙棘原汁为原料，通过S-04艾尔型酵母发酵成米草生物矿质液沙棘啤酒，其符合国家标准且具有营养保健价值和良好的饮用口感。近年来随着人们对健康的不断重视，对于啤酒的选择也越来越倾向于健康化、多样化。米草精酿啤酒的研究为消费者提供了更健康的选择，促进啤酒产业和当今社会的和谐发展。

本研究以大麦芽、小麦芽和米草提取液为原料，酿造米草精酿啤酒。通过单因素试验和响应面法对米草精酿啤酒酿造工艺条件进行优化，并对米草精酿啤酒的理化指标和生物活性物质进行检测，以期为米草精酿啤酒的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

麦芽（大麦芽、小麦芽）：永顺泰（昌乐）麦芽有限公司；90型颗粒酒花（青岛大花与萨兹）：雅基玛酒花有限公司；艾尔WB06型干酵母：法国弗曼迪斯；米草：江苏省盐城市沿海滩涂；邻苯二胺（分析纯）：济南铭锋生物科技有限公司；氯化钠、D-无水葡萄糖、苯酚、醋酸铅（均为分析纯）、芦丁标准品（纯度＞98%）：天津一方科技有限公司；黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2D超净工作台：上海复纳科学仪器有限公司；UV-5500PC分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；Countstar IY1200酵母细胞计数仪、糖化设备及发酵罐：艾力特生命科学有限公司；Haffmans浊度仪：广州鼎国生物技术有限公司；TD-50手持糖度计：上海棱光技术有限公司；FlexA-200全波长酶标仪：美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米草精酿啤酒的加工工艺流程及操作要点

操作要点：

麦芽粉碎：称取9 kg大麦芽和6 kg小麦芽，在间隙为0.2 mm的对辊粉碎机中进行研磨。在粉碎前向麦芽中添加麦芽质量5%的水，搅拌均匀使其湿润，保证麦芽在粉碎过程中麦皮破而不碎[9]。

米草提取液的制备：取米草地面以上部分100 kg，干燥、切段成2～3 cm，放入浸取罐中加热至沸腾，保温1～2 h，过滤除去固体，液体部分减压蒸发得褐色黏稠状液体，即为米草提取液。

糖化工艺：将粉碎好的麦芽加水以1.0∶3.5（g∶mL）的料水比进行分步糖化，在44 ℃进行投料，投料的同时开启搅拌，确保破碎的麦芽能够均匀地散布于水中。投料后保温20 min即可，然后加热到52 ℃，其间打开搅拌，以防麦汁受热不均而造成糊锅的现象，并恒温保温40 min左右；再将温度升高到65 ℃，维持70 min后温度升到78 ℃，在78 ℃下其他的酶基本失活，仅有一些α-淀粉酶仍有活性并终止糖化。

麦汁过滤：在过滤槽中注入78 ℃热水，正好没过筛板即可，糖化结束后将醪液通过糖化泵倒入过滤槽，待醪液全部倒入后静置20 min，回流之后开始过滤，通常回流2次就能达到澄清麦汁的目的。过滤时，流速不能太快，避免麦糟阻塞滤板，保证过滤后麦汁更清亮。用78 ℃热水进行两次洗糟，直至糖化锅内的麦汁达到目标糖度时停止过滤。

麦汁煮沸：分别在麦汁沸腾后10 min、30 min、60 min时添加酒花，酒花的总添加量为100 g，在前两次分别加入30%和50%的青岛大花（苦型酒花），在距煮沸完成的前10 min加入20%的萨兹啤酒花（香花）和10%米草提取液。煮沸的全部阶段需要70 min，需要控制好煮沸强度，煮沸完成后糖度应控制在（11±0.3）°P。

回旋沉淀及麦汁冷却：在煮沸完成后将加热停止，随后将麦汁转移至回旋沉淀槽中并静置20 min，20 min后在罐底排出形成的热凝固物，以防大颗粒物质堵塞板式换热器。麦汁进罐温度维持在22 ℃左右，在进罐过程中通入氧气，充氧量为10 mg/L。

发酵：称取艾尔WB06型干酵母，按酵母和水比例为1∶10的比例加入20 ℃无菌水中，搅拌均匀并静置20 min后使活菌数达到1.4×107CFU/mL，添加进发酵罐中，主发酵温度控制在22 ℃左右。定期检测发酵液外观糖度，待糖度降至4°P时进行封罐，发酵过程中罐内保持罐内压力为0.15 MPa，保压发酵，当罐内压力＜0.14 MPa时，及时补充二氧化碳。

降温冷贮：双乙酰的含量代表了啤酒是否成熟，当双乙酰质量浓度≤0.1 mg/L后，对发酵液进行降温操作。降至0 ℃，冷贮7 d。冷贮结束后，即得米草精酿啤酒。

1.3.2 米草精酿啤酒的酿造工艺条件优化

单因素试验：在1.3.1基础上，固定其他条件不变，分别考察米草提取液添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、酵母接种量（1.0×107CFU/mL、1.2×107CFU/mL、1.4×107CFU/mL、1.6×107CFU/mL、1.8×107CFU/mL）、发酵温度（18 ℃、20 ℃、22℃、24 ℃、26 ℃）对米草精酿啤酒精度及感官评分的影响。

响应面试验：在单因素试验结果的基础上，选择发酵温度（A）、酵母接种量（B）、米草提取液添加量（C）为自变量，以感官评分（Y）为响应值进行响应面试验设计，运用Design Expert 8.0.6软件设计3因素3水平的响应面试验，确定米草精酿啤酒的最佳酿造工艺条件，响应面试验因素与水平见表1。

表1 酿造工艺条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for brewing process conditions optimization

1.3.3 分析检测

米草精酿啤酒的酒精度、原麦汁浓度、双乙酰含量、色度、浊度、苦味值和总酸含量：参照GB/T 4927—2008《啤酒》分析方法测定；pH：采用pH计测定；细菌菌落计数：采用平板计数法测定；大肠杆菌：参照国标GB 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》中的计数法测定。

总黄酮的测定：采用芦丁比色法[10]；多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法[11]；DPPH自由基清除率测定：参考苏龙等[12]的方法；米草精酿啤酒XOD抑制率的测定：参考邹琳[13]的方法。

1.3.4 感官评价

在啤酒成熟以后，由经过培训的品酒员组成10人（6男4女）评审小组，分别从外观、泡沫、香气、口感4个方面对米草精酿啤酒进行感官品评[14]，满分为100分，米草精酿啤酒感官评分标准见表2。

表2 米草精酿啤酒感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of Spartina alterniflora craft beer

1.3.5 统计分析

采用软件Origin 2018绘图，采用SPSS 22.0统计软件对试验数据进行显著性分析、相关性检验。

2 结果与分析

2.1 酿造工艺条件优化单因素试验

2.1.1 发酵温度的确定

发酵温度对米草精酿啤酒品质感官评分的影响见图1。由图1可知，随发酵温度在18～22 ℃范围内的升高，米草精酿啤酒的感官评分和酒精度均呈升高的趋势；当发酵温度为22 ℃时，酒精度及感官评分均达最高值，分别为4.21%vol、89分；当发酵温度过高时，感官评分和酒精度均呈下降趋势。当发酵温度过高时，酵母代谢能力增强，产酒精能力提高，加快了啤酒发酵速度，导致过量挥发性物质生成，如酯类、高级醇等，且会产生过多H2S气味，对啤酒质量造成影响[15-16]。当发酵温度较低时，抑制酵母的活性使得发酵时间过长，产生的酯香味不足[17]。因此，确定最佳发酵温度为22 ℃。

图1 发酵温度对米草精酿啤酒品质的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on quality of Spartina alterniflora craft beer

2.1.2 酵母接种量的确定

酵母接种量对米草精酿啤酒品质的影响见图2。由图2可知，当酵母接种量为1.0×107～1.4×107CFU/mL时，感官评分和酒精度均呈升高趋势；酵母接种量为1.4×107CFU/mL时，感官评分、酒精度达到最高值，分别为88分、4.25%vol；当酵母接种量＞1.4×107CFU/mL时，感官评分及酒精度均降低，其原因可能是由于增加接种量时，双乙酰含量可能会随之增加，影响了酒体的整体口感，降低成品酒的香气及酒花香味[18-20]；同时，接种量的提高对挥发性醇酯的生成也有一定的影响[21]。因此，确定最佳的酵母接种量为1.4×107CFU/mL。

图2 酵母接种量对米草精酿啤酒品质的影响Fig.2 Effect of yeast inoculum on quality of Spartina alterniflora craft beer

2.1.3 米草提取液的确定

米草提取液添加量对米草精酿啤酒品质的影响见图3。由图3可知，当米草提取液在6%～10%范围内增加时，感官评分和酒精度均呈升高趋势；当米草提取液的添加量为10%时，感官评分、酒精度均达到最高值，分别为88分、4.31%vol；当米草提取液添加量＞10%时，感官评分和酒精度均呈下降趋势。当米草提取液添加量较低时，会导致米草的风味欠缺、口感不突出，当米草提取液添加量较高时，米草香味会掩盖麦芽以及酒花的香气进而会直接影响啤酒风味的协调性，也可能会对酵母的生长、繁殖产生影响。因此，确定最佳米草提取液添加量为10%。

图3 米草提取液添加量对米草精酿啤酒品质的影响Fig.3 Effect of Spartina alterniflora extract addition on quality of Spartina alterniflora craft beer

图4 各因素间交互作用对米草精酿啤酒感官评分影响的响应曲面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on sensory score of Spartina alterniflora craft beer

2.2 米草精酿啤酒酿造工艺条件优化响应面试验结果及分析

2.2.1 响应面试验结果及方差分析

以单因素试验结果为基础，以发酵温度（A）、酵母接种量（B）和米草提取液添加量（C）3个因素为自变量，以感官评分（Y）作为响应值，利用Design-Expert8.0.6软件进行响应面试验[22]。响应面试验设计及结果见表3，方差分析见表4。

表3 酿造工艺条件优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface tests for brewing process conditions optimization

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert8.0.6软件对表3试验结果进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程：Y=93.21+1.07A+2.11B+0.92C-1.78AB+0.26AC+0.60BC-2.48A2-5.36B2-3.51C2

由表4可知，所建立的响应面模型极显著（P＜0.000 1）；失拟项不显著（P=0.151 1＞0.05），说明该模型失拟并不明显[23]。决定系数R2=0.975 6，愈趋近于1，说明相关性愈强，试验误差也就愈小，方程拟合度好；调整决定系数R2adj=0.944 2，表明响应值94.22%的变化来自所选自变量；表明所建立的模型适用于优化米草精酿啤酒发酵工艺条件的分析[24]。本试验中的变异系数（coefficient of variation，CV）=1.15%，表明本试验精确度及试验重复性高[25]。由P值可知，一次项B、交互项AB、二次项A2、B2、C2对感官评分影响极显著（P＜0.01），一次项A、C对感官评分影响显著（P＜0.05），其他因素对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，3个因素对响应值的影响大小顺序为：酵母接种量（B）＞发酵温度（A）＞米草提取液添加量（C）。

2.2.2 响应面分析

通过三维图和等高线，可对响应面自变量的响应值和自变量之间的关系进行预测和检验[26]。响应面曲面图能够反映出各种因素之间交互作用对于响应值的显著性，曲面图愈陡峭，说明交互作用愈强烈，曲面越平坦，说明交互作用越微弱[27]。各因素间交互作用对米草精酿啤酒感官评分影响的响应曲面及等高线见图5。由图5a可知，AB间交互作用响应曲面坡度陡峭，等高线呈椭圆形，说明交互作用显著，酵母接种量与发酵温度对米草啤酒的感官评分影响较大[28]。AC、BC间交互作用的等高线呈近似椭圆形和圆形，响应面图类似山丘状曲面较为陡峭，说明发酵温度与米草提取液添加量、酵母接种量与米草提取液添加量之间有交互作用，但是交互作用不显著[29]，这与方差分析结果一致。

2.2.3 验证试验

通过建立回归模型，得出米草精酿啤酒的最佳酿造工艺条件为发酵温度22.33 ℃、酵母接种量1.44×107CFU/mL、米草提取液添加量10.32%，在此优化条件下，米草精酿啤酒感官评分的预测值达到93.5分。为了便于实际操作，将最佳米草精酿啤酒酿造工艺条件调整为：发酵温度22 ℃、酵母接种量1.4×107CFU/mL、米草提取液添加量10.3%，并在此条件下进行3次平行验证试验，得到的米草精酿啤酒感官评分实际值为93.4分。试验结果与模型预测值相近，说明模型合理可靠，具有实际意义。

2.3 米草精酿啤酒理化及微生物指标分析

2.3.1 理化指标及微生物指标检测结果

米草精酿啤酒理化指标及微生物指标检测结果见表5。由表5可知，其原麦汁的浓度为11.3°P、双乙酰含量为0.08 mg/L、色度为16.8 EBC、酒精度为4.32%vol、苦味值为15.4 IBU、总酸为2.05 mL/100 mL、浊度为71.6 EBC。大肠菌群未检出，细菌总数＜40 CFU/mL。米草精酿啤酒理化指标和微生物指标均符合相关国家标准。该工艺生产的米草精酿啤酒风味和谐、酒体外观纯净、泡沫细腻、杀口力强、具有鲜明的酒花香气。

表5 米草精酿啤酒理化指标及微生物指标检测结果Table 5 Determination results of physicochemical and microbial indexes of Spartina alterniflora craft beer

2.3.2 米草精酿啤酒生物活性物质分析

对实验室酿造的未添加米草的精酿啤酒（60%大麦芽＋40%的小麦芽）和米草精酿啤酒（60%大麦芽＋40%的小麦芽）的总黄酮、多糖含量、XOD抑制率和DPPH自由基清除率进行对比，结果见表6。

表6 米草精酿啤酒生物活性分析Table 6 Bioactivity analysis of Spartina alterniflora craft beer

由表6可知，添加米草的精酿啤酒中总黄酮、多糖含量和DPPH自由基清除率明显高于未添加米草的精酿啤酒，同时对XOD活性起到一定的抑制作用，抑制率可达到18.92%。说明米草的添加显著提高了米草精酿啤酒中总黄酮和多糖物质的含量（P＞0.05），进而影响了米草精酿啤酒的XOD抑制率。

3 结论

本研究采用单因素试验和响应面试验，对米草精酿啤酒酿造工艺条件进行了优化。结果表明，米草精酿啤酒的最佳酿造工艺条件为发酵温度22 ℃，酵母接种量1.4×107CFU/mL及米草提取液添加量10.3%。在最优发酵工艺条件下，其感官评分为93.4分，外观纯净，泡沫细腻、杀口力强、酒花香气显著并带有米草特有的甘甜。米草精酿啤酒总黄酮含量为110.85 μg/mL，多糖含量为13.15 μg/mL，DPPH自由基清除率为70.58%，黄嘌呤氧化酶抑制率为18.92%，其理化和微生物指标均符合相关国家相关标准，满足GB/T 4927—2008《啤酒》中的要求，本研究为米草精酿啤酒发展可行性研究奠定理论与实践基础，对于米草高效利用具有重要指导作用。