不同培养条件对小麦根际可培养微生物影响

吕路琼，欧阳由男，叶淑珍，游雨欣，李斌，王艳丽

(1.浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所 省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室 浙江省国家农作物品种抗性鉴定试验站，浙江 杭州 310021；2.中国水稻研究所，浙江 杭州 310006；3.浙江大学 生物技术研究所，浙江 杭州 310058)

植物在生长过程中为微生物的生长和增殖提供大量生态位，如植物的内部[1]、根际[2]和叶际[3]，这些微生物群体及其基因组统称为植物微生物组[4]。其中，与植物根部相关的微生物具有丰富多样性，大约有数万种，因而复杂的根际微生物又被称为植物的第二基因组[2]。伴随着植物的生命周期，根际微生物群落在植物营养和健康方面具有巨大潜力，如维持土壤功能、产生植物激素、抑制病原菌等多种途径，促进植物的生长发育、增强植物抗病性，是植物健康和生产力的关键因素[5]。由于根际微生物的复杂和重要程度，近年来受到了广泛关注[6]。

目前分离和培养植物有益微生物具有重要意义。这些分离到的微生物可以作为植物菌剂促进植物生长[7]、抵御生物胁迫[8]与非生物胁迫[9]。然而受培养基类型、培养条件等多种因素影响，在微生物培养过程中可实现不同种类微生物富集。例如在芦荟根内生细菌群落组成的培养中发现变形菌门在植物混合提取物培养基上为优势菌门，厚壁菌门在化学合成培养基上为优势菌门[10]。并且部分有益微生物在群体中比例较低，分离培养时很容易忽略，难以使研究者完整地理解植物微生物组及其整体功能。目前高通量测序技术已被广泛采用[11]，因为它们可以在一个样本中鉴定出数千到数百万个序列，揭示稀有微生物物种的丰度。

为探究不同培养方式对小麦根际微生物群落结构影响，本研究对小麦根际微生物取样后置于两种培养基与两个充氧量进行培养，5 d后进行16S rRNA高通量测序，从而揭示小麦可培养根际微生物群落特征，为小麦根际微生物资源开发与利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

选取中国水稻研究所试验田(杭州市富阳区黄田畈)种植的冬小麦扬麦20植株，试验田面积1 334 m2，按照“五点取样法”，每个取样点选取生长健壮一致的小麦植株3株，先用农具将冬小麦植株松土，取出根系，除去根系上附着的泥土颗粒，沿植株基部剪去根系，称重100 g根系，用1 L蒸馏水清洗麦根，用定性滤纸过滤，即为冬小麦根际微生物菌种，保存于4 ℃冰箱备用。

1.2 培养基

大米加工的细米糠 (M培养基)：米糠50 g(由浙江国稻高科技种业有限公司稻米加工厂提供)，蒸馏水1 000 mL。

LANDY改良配方培养基(L培养基)：葡萄糖20 g，L-谷氨酸钠5 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，蒸馏水1 000 mL。

LANDY培养基(D 培养基)：葡萄糖 20 g，L-谷氨酸钠5 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.15 mg，硫酸锰5 mg，硫酸铜0.16 mg，蒸馏水1 000 mL。

1.3 培养方法

将100 mL根际土壤溶液分别接种于M培养基(M处理)、L 培养基(L处理)和D 培养基(D处理)中，在微生物培养基(自主研发，ZL202120770944.2)中进行培养，培养温度为 28.5 ℃、充氧泵空气流量为100 L·min-1。将100 mL根际土壤溶液接种于L培养基，置于发酵罐(型号：JBF-100)培养作为对照，培养温度为28.5 ℃，充氧泵空气流量为8 L·h-1。培养5 d后收集样品并尽快测样。

1.4 DNA提取

根据制造商的说明，使用OMEGA土壤DNA分离试剂盒(OMEGA，Bio-Tek，Norcross，Norcross，GA，USA)从样品中提取总基因组DNA。使用NanoDrop (ND-1000)分光光度计(赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)测定提取DNA的质量。采用通用正向引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和通用反向引物806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对可培养根际细菌16S rRNA基因V3～V4区进行PCR扩增。将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，构建测序文库，Illumina PE250上机测序。

1.5 数据处理

使用R语言绘制箱线图，使用GraphPad Prism 8进行显著性分析，并绘制堆积柱形图与条形图。

2 结果与分析

2.1 Alpha多样性分析

为分析不同培养基对大麦根际微生物培养的群落差异，本研究分别使用M与L 2种培养基，在微生物培养基中进行培养，以置于发酵罐培养基中的L培养基作为对照，在培养5 d后收集不同处理的微生物样本(每个处理7个重复)，进行16S rRNA扩增子测序。共获得有效序列2 675 135条，平均每个样本127 387条序列，对应 17个门、28个纲、49个目、74个科、124个属。

Alpha多样性是指特定生境或者生态系统内的物种的丰富程度与多样性情况。Chao1指数主要关心样本的物种丰富度信息，数值越大，多样性越高。Shannon指数综合体现物种的丰富度和均匀度，数值越大，多样性越高。如图1所示，3种处理的Alpha多样性存在显著差异。其中D处理与M处理Chao1指数显著高于L处理，M处理的Shannon指数显著高于L处理且与D处理无显著差异。说明D处理与M处理丰富度与多样性高于L处理。

不同处理间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。A—Chao1指数；B—Shannon指数。图1 微生物群落 Alpha多样性分析Fig.1 Alpha diversity analysis of microbial community

2.2 群落组成分析

如图2中A所示，在纲水平上，小麦根际可培养微生物群落主要由γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)，拟杆菌纲(Bacteroidia)和芽孢杆菌纲(Bacilli)组成。其中D处理中γ-变形菌纲、拟杆菌纲和芽孢杆菌纲分别占比66.40%，17.44%，5.54%；L处理中γ-变形菌纲、拟杆菌纲和芽孢杆菌纲分别占比38.13%，3.61%，24.70%；M处理中γ-变形菌纲、拟杆菌纲和芽孢杆菌纲分别占比81.33%，3.09%，13.56%。如图2中B所示，在属水平上，大麦根际可培养微生物群落主要由克雷伯氏菌属(Klebsiella)，普雷沃氏菌属(Prevotella_9)和气单胞菌属(Aeromonas)组成。其中D处理中克雷伯氏菌属，普雷沃氏菌属和气单胞菌属分别占比43.88%，12.35%，5.86%；L处理中克雷伯氏菌属，普雷沃氏菌属和气单胞菌属分别占比8.61%，31.36%，12.72%；M处理中克雷伯氏菌属，普雷沃氏菌属和气单胞菌属分别占比9.41%，16.39%，24.00%。以上研究结果表明，大麦根际可培养微生物具有丰富的多样性，且不同培养条件对大麦根际微生物富集类群有很大差别。

A—纲水平；B—属水平。图2 小麦根际可培养细菌群落组成分析Fig.2 Analysis of the composition of cultivable bacterial communities in the wheat rhizosphere

2.3 FAPROTAX功能预测

FAPROTAX功能预测是利用多个已发表的可培养菌文章及自身的原核功能数据库，根据输入运算分类单元(OTU)信息提取功能完成预测。图3为3个处理间对应细菌群落功能注释预测的结果，不同处理样品之间细菌群落功能注释的预测结果存在很大差别。把细菌群落功能注释排名前10的表现出来，分为5个大类：化能异养、发酵、碳循环、氮循环、铁呼吸。D处理中与发酵、有氧化学异养、硝酸盐还原、固氮作用等功能相关的细菌群落相对丰度最高；L处理中与氮气呼吸、亚硝酸呼吸及亚硝酸氨化等功能相关的细菌群落相对丰度最高；M处理中与化能异样、芳香族化合物降解和铁呼吸作用等功能相关的细菌群落相对丰度最高。以上研究结果表明，大麦根际微生物含有多类植物有益菌，且不同培养方式会通过影响可培养微生物群落组成而影响其功能。

图3 小麦根际可培养微生物功能预测Fig.3 Function prediction of cultivable microorganisms in wheat rhizosphere

3 结论与讨论

在植物生长过程中，土壤微生物对其生长发育有着关键作用，因此，研究土壤微生物对促进农作物生长并提高产量具有关键作用[12]。然而自然环境中的微生物大多处于“贫营养”但营养元素丰富的状态，实验室中很难对自然环境进行模拟。同时在分离培养过程中，富营养细菌大量生长抑制寡营养细菌生长。目前能够在微生物培养基上形成菌落的细菌数量通常只占土壤中细菌总数的一小部分[13]。研究发现，培养基类型和氧气含量都会影响根际微生物群落组成[14]。本实验分别选用天然培养基与化学培养基，在两种充氧量下培养小麦根际微生物，5 d后采用16S rRNA高通量测序，以研究培养基类型与充氧量对小麦根际微生物影响。

在本实验中，使用高充氧量(微生物培养基)进行培养时，米糠培养基内细菌群落Alpha多样性高于LANDY改良配方培养基，表明天然培养基比化学培养基更有助于微生物培养。M处理中变形菌纲相对丰度最高，表明变形菌纲更易受培养基类型影响，该结果与前人[11]结果一致。自然培养基中含有大量未知天然营养成分，更适于微生物生长。在同时使用LANDY改良配方培养基时，低充氧量(发酵罐)的微生物群落Alpha多样性高于高充氧量环境(微生物培养基)，说明根际微生物存在于土壤内层，在培养过程中并不需要大量氧气。L处理中拟杆菌纲和芽孢杆菌纲相对丰度最高，表明这两种菌更易受充氧量影响。氧气含量在微生物培养过程中起到关键作用，这与前人[15]结果一致。

对小麦根际可培养微生物进行功能预测发现其含有很多促生菌，主要与化能异养、发酵、碳循环、氮循环、铁呼吸等功能相关。由此推测小麦根际富含的优势菌群对植物生长与健康具有重要作用。γ-变形菌纲在生理、形态和代谢等方面呈现出丰富的多样性，对环境适应性强，繁殖速度快，在生态系统尤其是土壤系统中占主导地位[16，17]。γ-变形菌纲对碳氮循环具有重要意义[18]，也在适应环境变化和抵御逆境胁迫方面发挥重要作用。拟杆菌纲与变形菌纲也是氮循环的主要贡献者。研究发现，随着施氮量的增加，优势类群中拟杆菌和变形菌相对丰度提高。嗜中性微好氧 FeOB均为变形菌门[19]。

本研究通过测定3种培养条件对小麦根际可培养微生物影响，结果表明，培养基类型和充氧量会显著影响小麦根际微生物富集。小麦根际微生物含有大量与植物促生相关微生物，对农作物生长具有关键作用。