高效液相色谱法同时测定纯阳正气胶囊中3 种成分的含量
2024-02-27蒙露露王宝艺韦飞雪柳荣英
文 艺，蒙露露，王宝艺，韦飞雪，邓 鹏，柳荣英
（1.八加一药业股份有限公司, 广西 桂林 541000；2.桂林市食品药品检验所, 广西 桂林 541012；3.桂林医学院药学院, 广西 桂林 541000）
纯阳正气胶囊是由广藿香、姜半夏、土木香、陈皮、丁香、肉桂、苍术、白术、茯苓等十七味中药制成的胶囊剂，主要用于治疗暑天感寒受湿、腹痛吐泻、胸膈胀痛、头痛恶寒、肢体酸重。纯阳正气胶囊是药典中收录的纯阳正气丸[1]的改良剂型，现代医学多用于改善肠胃功能、止泻等急性肠胃炎症状，其处方来源于晚清医书《饲鹤亭集方》，其中的陈皮理气健脾，活性成分橙皮苷可调节肠道菌群[2]、抑制肠道炎症[3]；肉桂能改善消化系统，活性成分桂皮醛抗溃疡、抗菌[4]；丁香温中、暖肾、降逆，活性成分丁香酚抑菌、镇痛[5]；各处方药材药性相辅相成。纯阳正气胶囊参照纯阳正气丸在质量标准的含量测定项下均只有橙皮苷的测定，不能全面评价该制剂的质量。多组分的定量分析已成为中成药质量控制的有效手段[6-7]。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）同时对纯阳正气胶囊中的橙皮苷、桂皮醛和丁香酚这3 个活性成分进行测定，完善其质量控制方法，为纯阳正气胶囊质量标准的提升提供了依据。
1 仪器和试药
1.1 仪器
Agilent1260 Infinity 型高效液相色谱仪、DAD检测器（Agilent Technologies 公司）；XS205DU 型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-600E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
图1 纯阳正气胶囊HPLC 图
1.2 试药
纯阳正气胶囊（ 批号： 200901、 201201、210201、211001，八加一药业股份有限公司）；橙皮苷对照品（批号：110721-202019）、桂皮醛对照品（批号：110710-201821）、丁香酚对照品（批号：110725-201917）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，Merck 公司）；其他试剂均为分析纯；水为去离子水。
2 方法和结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm,4 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱程序为0 ～5 min，15%乙腈；5 ～10 min，15%～25%乙腈；10 ～12 min，25%～ 50%乙腈；12 ～16 min，50%～15%乙腈；柱温为35 ℃；检测波长为284 nm；流速为1.0 ml/min，进样量为10 μl。
2.2 对照品溶液的制备
取橙皮苷、桂皮醛和丁香酚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成浓度为1 125、510、991 μg/ml的标准储备液。精密吸取橙皮苷储备液5 ml、桂皮醛储备液1.25 ml、丁香酚储备液4 ml 置于同一25 ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成混合对照品储备液。精密吸取上述混合对照品储备液适量，加甲醇稀释制成含橙皮苷36 μg/ml、桂皮醛4.08 μg/ml和丁香酚25.37 μg/ml 的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品10 粒内容物研磨均匀，取粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声20 min，放冷至室温，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按纯阳正气胶囊处方及制剂工艺，分别制成缺陈皮、缺肉桂和缺丁香的阴性样品，取阴性样品按“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
2.5 专属性及系统适用性考察
分别取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样，记录色谱图及相关参数。橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的保留时间依次为6.983、10.399、11.729 min，分离度均大于1.5，理论塔板数按橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的峰计算分别为54 733、59 111 和83 997，且阴性样品在对照品相应位置没有吸收峰，表明其他成分对测定无干扰，结果见图1。
2.6 线性关系考察
分别精密吸取“2.2”项下的混合对照品储备液0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 ml，置10 ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，按“2.1”项下的色谱条件进行测定。以峰面积Y对浓度X（μg/ml）进行线性回归，结果见表1。
表1 线性关系考察结果
2.7 精密度试验
取“2.2”项下制备的混合对照品溶液， 按“2.1”项下的色谱条件进行测定，橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的峰面积RSD 分别为1.21%、1.14%、0.96%(n=6)，表明该方法精密度良好。
2.8 稳定性试验
取“2.3”项下制备的供试品溶液（批号：210201），分别于0、2、4、6、8、12、24 h 按“2.1”项下的色谱条件测定，记录峰面积。结果橙皮苷、桂皮醛和丁香酚峰面积的RSD 分别为1.28%、1.38%、2.77%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。
2.9 重复性试验
取同一批次的纯阳正气胶囊（批号：210201）6 份，按“2.3”项制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，记录色谱峰面积并计算含量。结果橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的平均含量分别为4.14、0.45、3.06 mg/g，RSD 分别为1.43%、1.71%、1.63%（n=6），表明该方法的重复性良好。
2.10 加样回收率试验
取已知含量的同一批次的纯阳正气胶囊9 份（批号：210 201），每份约0.1 g，分别精密加入混合对照品储备液适量，配制成低、中、高3 个不同浓度的回收率溶液，每个浓度3 份，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法操作，按“2.1”项下的色谱条件测定，记录峰面积并计算回收率。结果显示，橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的平均回收率分别为101.9%、98.0%、101.2%，RSD 值分别为2.3%、1.6%、2.3%(n=9)。
2.11 样品含量测定
取4 批样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积并计算含量，结果见表2。
表2 4 批次样品含量测定结果(mg/g，n=3)
3 讨论
3.1 色谱条件的选择
对于流动相的选择，本实验参考相关研究分别考察了乙腈-0.5%磷酸溶液[8]、甲醇-水[9]、乙腈-水[10]作为流动相时对橙皮苷、桂皮醛、丁香酚色谱峰的影响。其中，乙腈-0.5%磷酸流动相无法使3 种成分分离；甲醇-水流动相峰形矮且不尖锐，基线不平稳；乙腈-水流动相效果最佳，3 种成分分离度均大于1.5，峰形良好。对于检测波长的选择，DAD 检测器全波长扫描显示橙皮苷、桂皮醛、丁香酚分别在282、290、284 nm 波长处有最大吸收，3 种成分最大吸收波长相近，故选择284 nm 作为检测波长，不影响3 种成分的吸收。
3.2 提取条件的考察
纯阳正气丸对橙皮苷的含量测定采用了加热回流的方法，因此本实验分别考察了回流和超声两种提取方式。加热回流提取时桂皮醛含量的RSD较大，回收率差，考虑桂皮醛属于易挥发性物质[11]，受温度影响大，文献[12]报道也多以超声提取为主，最终选择以超声作为提取方式，分别考察了超声时间和提取溶剂。分别比较20、30、40 min 超声的提取效果，20 min 为最佳提取时间；考虑橙皮苷、桂皮醛和丁香酚在溶剂中的溶解度，分别比较了甲醇、乙醇、稀乙醇和50%乙醇的提取效果，结果显示甲醇提取时指标成分含量较高，且无峰干扰，提取效果好。最后确定以甲醇作为提取溶剂，超声提取20 min 的提取方法，简单便捷、结果准确。
3.3 含量测定结果分析
对4 批纯阳正气胶囊中橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的含量进行分析，结果显示不同批次样品橙皮苷和桂皮醛的含量差异较大，丁香酚的含量波动较小，这有可能与不同来源和不同批次药材的质量有关，这提示我们在制订含量限度的时候除了要控制工艺，还要充分考虑药材对终产品的影响，本次试验只测定了4 批不同批次的纯阳正气胶囊样品，后续将增加更多不同批次的样品进行测定研究，提升纯阳正气胶囊的质量标准。
