鼠棒状杆菌层析免疫检测方法的建立及应用

余建国 朱楼英

(1.金华职业技术学院 浙江金华 321017；2.金华市实验动物中心 浙江金华 321007）

鼠棒状杆菌 （Corynebacterium kutscheri，CK）主要寄生于大小鼠上呼吸道，为动物源性致病菌，常为隐性感染[1]。 临床上主要表现伪结核症状或化脓性炎症，在鼠免疫功能损伤或抑制、外界环境改变时，可引起急性死亡[2]。

实验动物国家检测标准中， 鼠棒状杆菌是清洁级大鼠、小鼠必须排除的项目[3]。 鼠棒状杆菌调查诊断方法目前有病原菌分离培养方法、免疫学方法、分子生物学（PCR） 方法。 实验动物的国家标准（GB/T14922-2011）中规定的检测方法也是细菌学分离、血清学检测，操作复杂、耗时长，容易造成漏检。PCR法虽然灵敏、快速，但仪器设备要求高，检测成本昂贵，不适合基层规模推广应用。

单克隆抗体技术的发展及其优越性，在农业、医学等生物技术领域得到了广泛的应用。 在鉴定细菌种类方面， 单克隆抗体技术具有的高灵敏性和高特异性是其他方法无法比拟的。 以灵敏且特异度高的单克隆抗体， 构建出可用于临床快速检测的免疫层析学方法，对临床鼠棒状杆菌筛查具有积极的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 BALB/c 雌性小鼠（6～8 周龄），由金华市实验动物中心提供；鼠棒状杆菌纯培养菌体，由浙江省实验动物中心惠赠。

1.1.2 试剂 鼠棒ELISA 试剂盒、 牛血清白蛋白、卵清蛋白等，市售；鼠棒状杆菌单克隆抗体、鼠棒状杆菌单抗检测试纸、 小鼠致敏血清，PBS、CBS 等缓冲液由实验室制备。

1.2 方法

1.2.1 单抗效价和灵敏度测定 采用间接ELISA法， 测定杂交瘤细胞培养上清诱导小鼠产生的腹水效价， 抗体浓度依次为2×102、4×102、8×102、16×102、32×102、64×102、128×102。 配制浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 ng/mL 的CK 菌液悬液，用作灵敏度检测。

1.2.2 抗体特异性的鉴定 以间接竞争ELISA 法，设定泰泽氏菌（BP）、巴氏杆菌（PMU）、沙门氏菌（SE）、弓形虫（TO）为参照，检测单抗与CK 类似物的交叉反应。

2 结 果

2.1 单抗的效价和灵敏度检测结果 单抗效价检测结果见表1，第4 次免疫10 d 后，4 只受免鼠均产生了血清学抗体，效价在1.6×103～1.28×104，抗体水平均值非常高。 免疫小鼠血清单抗灵敏度检测结果见表2。

表1 单抗效价检测结果

表2 单抗灵敏度检测结果

2.2 鼠棒单抗（CK-mAb）特异性鉴定 3 号小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 融合后，经过有限稀释法[4]亚克隆和ELISA 筛选，最后得到1 株能够稳定分泌抗CK-mAb 的杂交瘤细胞09A2B5， 通过体内诱生腹水法批量制备出抗体。 间接ELISA 测定腹水效价， 细胞上清的效价为1:1 600； 腹水的效价为1.256×105。从特异性试验结果可知（见表3），单抗与泰泽氏菌（BP）、巴氏杆菌（PMU）、沙门氏菌（SE）、弓形体 （TO） 的交叉反应比例分别为1.47%、0.91%、0.42%、0.06%。

表3 特异性试验结果

2.3 胶体金-鼠棒状杆菌抗原结合物的制备

2.3.1 胶体金制备 先将0.1 g/L HAuCl4在煮沸状态下与10 g/L 柠檬酸三纳结合， 后用0.2 mol/L K2CO3调整金溶胶pH 至8.2。之后加入制备的抗原，混匀后经离心处理，将沉淀物复溶于金稀释液。

2.3.2 胶体金标记抗体制备 取制备的胶体金溶液1 mL， 用0.2 mol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液pH至8.5。 加入0.01 mg 抗鼠棒状杆菌单克隆抗体，轻微震荡混匀，室温下静置1 h。再逐滴加入10%BSA 10 μL， 充分混匀后静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。 弃上清，加入含0.1%BSA、0.01% Pro-Clin300 的 0.05 mol/L Tris -HCl 溶液（pH8.5）0.01 mL，使金-抗体复合物重悬，4 ℃保存备用。

2.3.3 试纸条组装 以纯化后的抗体各自作为包被抗体与标记抗体进行相互配对。试纸条由样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸和不干胶保护层组成。 金标结合垫浸着抗原，37 ℃烘干；硝酸纤维素膜分别用鼠棒状杆菌抗原（0.01 mol/L PBS 液稀释）和单克隆抗体包被成检测线和质控线， 干燥后用含犊牛血清(10 g/L)的PBS 液封闭（37 ℃、30 min）。 于10 mL 金溶胶中加入300 μg 抗体蛋白， 充分搅拌、混匀； 约10 min 后用3%PEG20000 溶液作为稳定剂， 至PEG20000 终含量为0.05%， 再充分搅拌10 min，8 000 r/min 离心。离心后，保留管底疏松的粉红色沉淀部分（胶体金标记的抗体），取2 mL 标记后的抗体，均匀涂在5 cm×5 cm 玻纤上，置于干燥房内风干，组装试纸条进行检测（见图1）。

图1 试纸条组装示意图

2.4 试纸条性能检测

2.4.1 试纸条最低检出限测试 将鼠棒状杆菌标准菌株复苏、增菌培养、测定细菌数量后，用PBS 稀释至浓度为0、10-5、10-6、10-7、10-8CFU/mL， 分别取100 μL 加入至900 μL 抽提液（加入至抽提液后实际菌体浓度相应为0、10-4、10-5、10-6、10-7CFU/mL），反应5～10 min 后使用，并以其对试纸条（随机选取1-4 号检测条）最低检出限进行检定。 由表4 可知，1-4 号检测试纸条均能与鼠棒状杆菌稀释液发生反应，10-4CFU/mL、10-5CFU/mL 两个浓度均为阳性，10-7CFU/mL 均为阴性，10-6CFU/mL 菌液浓度75%为阳性， 判定试纸条检测菌液浓度最低限为106CFU/mL。

表4 试纸条最低检出限检测结果

2.4.2 试纸条交叉反应测试 将鼠棒状杆菌、 大肠杆菌、沙门氏菌标准株增菌培养。 测定细菌数量，均用PBS 稀释至浓度为10-9CFU/mL， 分别取100 μL加入至900 μL 抽提液 （加入至抽提液后实际菌体浓度相应为10-8CFU/mL），反应5～10 min 后使用，随机选取5 条检测试纸， 并以上述菌液对试纸条有无交叉反应进行检定。 由表5 可知， 试验选取的5 条试纸均能与鼠棒状杆菌菌液产生阳性反应。 对照所用大肠杆菌、沙门氏菌与试纸条均无反应，但与阳性对照能产生阳性反应。 表明项目选取的试纸条特异性好，与其他菌株不易产生交叉反应。

表5 试纸条交叉反应试验结果

2.4.3 临床应用及示范 在相关实验动物中心进行鼠棒状杆菌感染抽样调查， 用同批次试纸条检测随机采集的50 份大鼠血清、50 份小鼠血清， 并以ELISA 法做平行对照。 ELISA 检测方法按标准方法进行，经包被、洗涤、封闭、显色；以终止液终止反应后， 调整酶标仪测吸光值A450；S/N≥2.1 判为阳性。以PBS 液将待检血清按1:5 稀释； 检测时从加样孔滴加2～3 滴待检血清稀释液，同时以标准阳性血清和阴性血清设阳性对照和阴性对照；2～5 min 内观察结果；10 min 后观察结果无效。 判定标准：检测区（T 带）、质控区（C 带）均出现红色判为阳性；仅质控区（C 带）出现红色判为阴性；T、C 均未出现红色则试纸无效。 检测结果见表6。

表6 小鼠、大鼠棒状杆菌不同方法检测结果

3 讨论与分析

在单克隆抗体制备中， 高效价抗体的获取相对简易。 但抗体的特异性会因杂蛋白感染而呈现异常[5]。 本试验制备的鼠棒状杆菌单克隆抗体（CKmAb），具有良好的特异性，为构建血清学快速检测方法（免疫层析检测法）奠定了坚实的基础。

本研究在筛选瘤细胞系过程中采用了有限稀释法，该法的缺点是需要进行多次克隆。 有文献提示，甲基纤维素半固体培养基法可以较好解决这一问题[6]，在未来的研究中，可以开展试验探索。

实验动物的快速检测技术相对缺乏， 以小鼠棒状杆菌单克隆抗体为基础的快速检测方法的构建，为实验动物微生物评价和质量控制提供了一条新的途径。尤其是在病毒测定中，快速检测可以发挥积极的作用。