中国主要油茶产区山茶炭疽菌群体遗传结构分析

王义勋 徐小文 郑露 黄俊斌 谢先斌

摘要：以中國主要油茶产区的油茶（Camellia oleifera Abel.）炭疽病优势种山茶炭疽菌（Colletotrichum camelliae）的16个地理种群168个菌株为供试材料，应用ISSR分子标记技术进行遗传多样性和种群遗传结构分析。16个地理种群的多态位点百分比（PPB）为98.99%，Neis基因多样性指数（He）为0.28，Shannon信息多样性指数（Is）为0.43，遗传相似度（I）平均为0.834，遗传距离（D）平均为0.183，表明山茶炭疽菌遗传多样性水平较高且异质性较强，种群间存在一定程度的遗传变异，遗传距离与地理距离之间无相关性。湖北省、浙江省、江西省、湖南省和广西5个省级种群总基因多样度（Ht）为0.274 8，遗传分化系数（Gst）为0.517 4，基因流（Nm）为0.466 4，表明山茶炭疽菌5个省级种群虽然被分化，但是不存在基因流动现象（Nm<1）。

关键词：山茶（Camellia oleifera Abel.）；炭疽菌（Colletotrichum camelliae）；ISSR；遗传多样性；种群遗传结构；油茶产区

中图分类号：S763.1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）01-0212-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.01.038 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Population genetic structure analysis of camellia anthracis fungus in the main oil tea producing areas of China

WANG Yi-xun1， XU Xiao-wen1， ZHENG Lu2， HUANG Jun-bin2， XIE Xian-bin3

（1.Hubei Academy of Forestry， Wuhan  430075，China； 2.College of Plant Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan  430070，China；3. Yunxi County Forestry Bureau， Shiyan  442600，Hubei，China）

Abstract： Using 168 strains from 16 geographical populations of camellia anthracis fungus （Colletotrichum camelliae Abel.）， a dominant species of camellia anthracis in the main camellia producing areas of China， as the test materials， ISSR molecular marker technology was used to analyze genetic diversity and population genetic structure. The percentage of polymorphic loci （PPB） for 16 geographical populations was 98.99%， the Neis gene diversity index （He） was 0.28， the Shannon information diversity index （Is） was 0.43， the average genetic similarity （I） was 0.834， and the average genetic distance （D） was 0.183. This indicated that the genetic diversity level and heterogeneity of camellia anthracis fungus were high， and there was a certain degree of genetic variation among populations. There was no correlation between genetic distance and geographical distance. The total genetic diversity （Ht）， genetic differentiation coefficient （Gst）， and gene flow （Nm） of the five provincial-level populations in Hubei， Zhejiang， Jiangxi， Hunan， and Guangxi provinces were 0.274 8， 0.517 4， and 0.466 4， respectively. This indicated that although the five provincial-level populations of camellia anthracis fungus were differentiated， there was no gene flow phenomenon （Nm<1）.

Key words： camellia（Camellia oleifera Abel.）； anthracis fungus（Colletotrichum camelliae）； ISSR； genetic diversity； population genetic structure； oil tea producing areas

收稿日期：2022-07-23

基金项目：湖北省重点研发计划资助项目（2020BBA042）

作者简介：王义勋（1978-），男，山东日照人，博士，主要从事林业有害生物防治研究，（电话）027-86952170（电子信箱）yixun2002@163.com。

油茶（Camellia oleifera Abel.）属山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia L.），是中国重要的木本油料树种之一，与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本油料植物。油茶在中国已有2 300多年栽培历史，主要分布在中国湖北省、安徽省、浙江省、江西省、湖南省、福建省和广西壮族自治区等长江流域及以南地区，在越南、缅甸、泰国、马来西亚及日本等东南亚国家也有少量分布［1，2］。油茶适宜荒山、丘陵种植，在中国栽培面积达4.5×104 km2，茶油产量达62.7万t。茶油是油茶籽经压榨而成，是一种高品质食用油，素有“东方橄榄油”“油中之王”的美誉，属天然绿色食品，以油酸和亚油酸为主的不饱和脂肪酸含量超过90%，长期食用能够预防心脑血管疾病［3，4］。此外，油茶多种植在荒山、丘陵，不与粮棉争地，能够保持水土、改善生态环境，具有重要的生态价值［5］。

油茶炭疽病的病原菌有Colletotrichum camelliae、Colletotrichum fructicola、Colletotrichum siamense、Colletotrichum aenigma、Colletotrichum gloeosporioides等多种炭疽菌，其中Colletotrichum camelliae、Colletotrichum fructicola和Colletotrichum siamense为优势种［6，7］。朱丹雪等［8］对145个Colletotrichum fructicola的ITS序列进行群体遗传结构分析，推导出13种单倍体型（Haplotype），Haplotype 5为优势单倍体型；种群间和种群内的遗传变异分别占总变异的13%和87%；地理距离与遗传分化没有显著的线性关系。李杨等［9］采用ITS、CAL和GAPDH序列对57个Colletotrichum siamense进行群体遗传结构分析，该种群具有丰富的遗传多样性，不同地理种群间的遗传分化较大，且病菌经历过大规模的种群扩张。目前油茶炭疽病菌优势种Colletotrichum camelliae的群体遗传结构尚无相关文献报道。本研究采用锚定简单重复序列（Inter-simple sequence repeat，ISSR）技术对湖北省、湖南省、安徽省、江西省、浙江省、福建省和广西等不同地理来源的Colletotrichum camelliae遗传多样性和种群结构以及不同种群间的遗传关系进行研究，为该病害防治和抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

从湖北省、湖南省、安徽省、江西省、浙江省、福建省和广西等16个地区（图1）的油茶成年林中采集具有典型症状的油茶炭疽病病叶、病果等样本，采用真菌组织分离法进行病原菌分离［10］，经形态学特征和多基因分子鉴定出山茶炭疽菌（Colletotrichum camelliae）168个菌株［7］，保存于PDA斜面上，于4 ℃冰箱中贮存备用。

1.2 DNA提取和引物筛选

将供试菌株接种到铺有玻璃纸的PDA培养基上，于培养箱中25 ℃培养5 d，收集菌丝体，然后采用CTAB法提取各菌株的基因组DNA［11］，以1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，最后用核酸测定仪测得浓度后，将样品于-20 ℃保存备用。

参照文献［12］的方法，以不同来源的18个代表性菌株基因组DNA为模板，使用22条供试引物（表1）进行ISSR-PCR预扩增，筛选出扩增条带清晰、多态性高、重复性好的引物用于供试菌株的PCR反应。

1.3 ISSR扩增

ISSR-PCR扩增反应在TP-600型PCR扩增仪（宝日医生物技术（北京）有限公司）上进行。本试验所用的10×PCR Buffer（含2.5 mmol/L MgCl2）、Taq DNA聚合酶、dNTPs及Ladder Maker Ⅲ购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由武汉擎科生物技术有限公司合成。反应体系：10×PCR Buffer（含MgCl2）2.5 μL；2.5 mmol/L dNTP 1 μL，2 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L引物1 μL，DNA模板20 ng，以ddH2O补齐25 μL。扩增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，44～54.5 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，共35个循环；72 ℃ 10 min。使用1.5%琼脂糖凝胶（含SYBR@ GreenⅠ荧光染料）对PCR产物进行电泳。电泳结束后使用Bio-Rad凝胶成像系统检测并拍照。

1.4 数据处理与聚类分析

以Ladder Maker Ⅲ为参照确定条带的大小，按照扩增条带的有无进行统计，分别记为“1”和“0”，从而将PCR扩增的DNA条带转换成二进制数据资料，将其保存成Excel文件格式。利用Popgene 1.32软件计算各种群的等位基因数（na）、有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样性指数（He）、Shannon信息多样性指数（Is）、多态位点百分比（PPB）、 群体内基因多样度（Hs）、总基因多样度（Ht）、群体间遗传多样性（Dst）、遺传分化系数（Gst）、基因流（Nm）、遗传相似度（I）和遗传距离（D）。利用NTSYS-pc（Version 2.1）软件计算菌株间的相似系数，以SHAN程序中的UPGMA（非加权算数平均聚类）法对菌株个体之间使用相似性系数进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 ISSR引物多态性分析

以不同来源的18个代表性菌株基因组DNA为模板，从22条引物中筛选7条引物，扩增条带多、重复性好、带型清晰，扩增片段大小为400～2 000 bp，扩增条带数为90条，多态性条带数为84条，多态位点百分比为86.7%～100.0%，并建立了ISSR最佳反应体系，可用于本研究（表2）。

2.2 种群的遗传多样性水平分析

将168个山茶炭疽菌作为一个种群进行遗传多样性分析，结果表明种群的总体PPB为98.99%、He为0.28、Is为0.43（表3），总体上显示山茶炭疽菌的遗传多样性水平较高，种群的异质性较强。16个地理种群的PPB在9.09%（湖北省红安县）～68.69%（湖南省长沙市）；与总的PPB相比，各地理种群的PPB相对较小，且彼此间有明显差异。He在0.04（湖北省红安县）～0.22（湖南省长沙市、江西省宜春市、江西省永修县），Is在0.05（湖北省红安县）～0.34（湖南省长沙市）。由此可知，湖南省长沙市种群PPB和多样性指数（He和Is）均最大，表明该种群遗传多样性最高；而湖北省红安县种群的PPB和多样性指数（He和Is）均最小，表明该种群遗传多样性最低。

2.3 种群的遗传相似度及遗传距离

利用 Popgene 1.32 软件对16个地理种群的遗传相似度I和遗传距离D（表4）进行分析，16个地理种群的I平均为0.834，D平均为0.183。I在0.702（湖北省红安县/广西三江县）～0.970（江西省宜春市/江西省南昌市），D在0.030（江西省宜春市/江西省南昌市）～0.353（湖北省红安县/广西三江县）。采用UPGMA法对16个地理种群进一步聚类（图2），16个地理种群聚类成3个分支，湖北省、福建省和安徽省的6个地理种群聚为第一分支；湖南省、江西省、浙江省的8个地理种群聚为第二个分支；而广西的2个地理种群聚为第三个分支。这些数据表明，山茶炭疽菌的16个地理种群之间存在一定程度的遗传变异，且遗传距离与地理距离之间无明显的相关关系。

2.4 种群的遗传分化

由表5可知，湖北省、浙江省、江西省、湖南省和广西5个省级种群Ht为0.274 8，Hs为0.132 6，Dst为0.142 2，Gst为0.517 4，Nm为0.466 4。按照种群遗传学［13］的标准，种群存在高度遗传分化（Gst大于高度遗传分化阈值0.15），其总变异中51.74%是由于种群间变异所造成的，而48.26%是由于种群内变异所造成的，即由各省份不同采集地以及采集地不同生境间的差异所造成的。虽然种群被强烈分化，但是不存在基因流动现象（Nm小于基因流动阈值1）。其中，湖北省种群的Gst为0.523 6，Nm为0.454 9，表明其遗传分化多发生于湖北省种群间，且基因交流受到抑制；而浙江省、江西省、湖南省和广西种群的Gst在0.149 1（江西省）～0.255 9（浙江省），Nm在1.454 2（浙江省）～2.854 6（江西省），表明其遗传分化性多发生于各省级种群内，且存在一定的基因流动。

2.5 菌株个体聚类分析

利用NTSYS-pc软件（Version 2.1）对168个菌株个体进行UPGAM法聚类分析。在遗传相似系数为0.70水平上168个菌株个体被聚类成3个大类群，湖北省麻城市、湖北省红安县、湖北省黄陂区、湖北省竹山县、福建省闽侯县和安徽省舒城县的菌株个体被聚类成第1类群；湖南省浏阳市、湖南省长沙市、湖南省德阳市、广西三江县、广西南宁市、浙江省青田县和浙江省松阳县的菌株个体被聚类成第2类群；江西省南昌市、江西省永修县和江西省宜春市的菌株个体被聚类成第3类群。第1类群和第2类群的菌株个体随机混杂交错，遗传关系密不可分，与湖北省、福建省、安徽省、湖南省、广西、浙江省地理种群之间的遗传分化系数均较大、群间相似度均较小的结果基本一致，但是广西菌株个体和江西省菌株个体与其地理种群间聚类的结果不一致。该聚类结果也表明，168个菌株之间具有丰富的遗传多样性，且遗传多样性与其地理来源无明显相关性。

3 小结与讨论

炭疽菌分布广泛、寄主繁多，能够引起叶斑、果腐、枝枯等症状，造成巨大经济损失，是一类重要的植物病原真菌［14-16］。油茶炭疽病是由Colletotrichum camelliae、Colletotrichum fructicola、Colletotrichum siamense、Colletotrichum aenigma、Colletotrichum gloeosporioides等多种炭疽菌引起，其中Colletotrichum camelliae、Colletotrichum fructicola和Colletotrichum siamense为优势种［7］。Li等［6］采用ITS、CAL、GS和GAPDH序列对167个Colletotrichum fructicola进行群体遗传结构分析，推导出53种基因型，不同地理群体间具有遗传分化现象。李杨等［9］采用ITS、CAL和GAPDH 序列对57个Colletotrichum siamense进行群体遗传结构分析，不同地理种群间的遗传分化较大，且病菌经历过大规模的种群扩张。但是关于油茶炭疽病菌优势种Colletotrichum camelliae的群体遗传结构尚无相关文献报道。ISSR技术是利用真核生物基因组中简单重复序列来设计引物，具有多态性高、稳定性好、检测位点多、可靠性强等优点［17］，且在植物病原菌遗传多样性［18］、遗传变异和种群结构［12，19］等研究中得到應用。

本研究以优势种Colletotrichum camelliae为研究对象，利用筛选的7条多态性引物和优化的ISSR-PCR反应体系对168个代表性Colletotrichum camelliae菌株进行DNA指纹图谱分析，多态位点百分比（PPB）为98.99%，Neis基因多样性指数（He）为0.28，Shannon信息多样性指数（Is）为0.43，Colletotrichum camelliae具有丰富的遗传多样性，表明在进化过程中Colletotrichum camelliae发生了较高水平的遗传变异；16个地理种群的I为0.834，D为0.183，且被聚类成3个分支，表明Colletotrichum camelliae各地理种群之间存在一定遗传变异性，且遗传距离与地理距离之间无明显的相关关系，与其他植物病原真菌的遗传多样性分析结果基本一致［20，21］。对湖北省、浙江省、江西省、湖南省和广西5个省级种群而言，Gst为0.517 4，Nm为0.466 4，表明Colletotrichum camelliae省级种群虽然被强烈分化，但是不存在基因流动现象（Nm<1），而Colletotrichum fructicola和Colletotrichum siamense经历过种群扩张，种群间存在有效基因流［8，9］。人们对病原菌种群遗传多样性、群体遗传结构有了深入了解，对研究油茶炭疽病的流行规律、科学防治和抗病育种具有重要的意义。

由于中国地域辽阔、生态环境多样、寄主植物繁多，这些因素都会影响炭疽真菌遗传进化［22，23］。本研究仅采集了7个省份16个区域的168株Colletotrichum camelliae，而且每个省份只有1～4个点，后期增补一些不同海拔、不同油茶品种和不同寄主植物上的Colletotrichum camelliae菌株进行遗传多样性分析。此外，将不同种群的炭疽菌ISSR指纹图谱进行对比分析，利用其特有标记条带序列开发特异性分子标记，并将快速检测技术应用于生产。

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