两种重要经济石斑鱼肠道微生物群落结构及代谢功能的比较分析*

杜倩平 谢广婷 钟仲轩 张明清, 吴锦辉 舒 琥①

(1. 广州大学生命科学学院 广东广州 510006; 2. 中山大学生命科学学院 广东广州 510275; 3. 广东省农业技术推广中心 广东惠州 516081)

肠道微生物群落可以通过发酵宿主难以消化的食物成分、代谢多种化合物参与宿主的生长、代谢以及免疫反应等生理过程, 并能与中枢神经系统相互作用, 影响大脑功能, 是宿主体内的重要组成部分(Flintetal, 2012; Clarkeetal, 2014; Liuetal, 2023)。Lee 等(2022)研究发现, 提高肠道微生物来源的短链脂肪酸能够缓解老年脑卒小鼠的神经缺损与炎症。Duca 等(2012)研究结果表明, 缺乏肠道微生物的无菌小鼠其瘦素和生长素释放肽水平明显降低, 即使摄入更多的热量, 仍然比对照组小鼠更瘦。在鱼类中, 肠道微生物同样与营养物质的消化、吸收以及免疫反应息息相关。Abid 等(2013)揭示了肠道微生物对大西洋鲑(Salmosalar)肠黏膜细胞的保护作用: 肠道微生物可以改善肠道黏膜细胞的形态并刺激先天性免疫反应。Li等(2023)证明, 宿主遗传学与肠道微生物群落的相互作用能够改善杂交鱼(Megalobramaamblycephala♀ ×carnivorousCulteralburnus♂)的摄食行为, 厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和绿菌门(Chloroflexi)的丰度与宿主生长水平呈正相关。因此,对鱼类肠道微生物进行表征, 在解析其性状方面具有重要的意义。

与淡水养殖相比, 海水养殖不受土地稀缺和水资源供应不足的影响, 其在满足日益增长的食物需求方面具有巨大的潜力(Wuetal, 2021a)。自2000 年起, 中国海水养殖产量稳步增长, 产值逐年提高:2020 年中国海水养殖产量达到2 135.31 万t, 产值达到 3 836.20 亿元(农业农村部渔业渔政管理局等,2021)。石斑鱼因其营养价值高、肉质细嫩、味道鲜美等优点深受消费者喜爱, 是重要的海水养殖鱼种。2020 年, 中国石斑鱼产量为19.20 万t, 相较2016 年增长77.3%, 其中虎龙杂交斑(Epinephelusfuscoguttatus♀ ×E.lanceolatus♂)占市场份额的70%以上(Yanget al, 2021)。虎龙杂交斑继承了其亲本生长速度快、抗逆性能强的优点, 并且口感极佳、经济效益高, 能够承受较高的养殖密度, 是水产养殖户和消费者的首选种类(Sunetal, 2016; Tanetal, 2019; Amoahetal,2022)。此外, 斜带石斑鱼(E.coioides)亦是东南亚国家常见的经济养殖石斑鱼品种, 同样具有营养丰富、味道鲜美、易于饲养的特点(Baietal, 2021; Xiao Joeetal, 2021; Laietal, 2022)。

目前, 虎龙杂交斑和斜带石斑鱼作为具有重要经济价值的石斑鱼养殖品种, 相关研究主要集中在其营养、摄食、生长、免疫等方面, 关于其肠道微生物群落的结构与功能的比较研究暂未见报道。因此,本研究利用16S rDNA 高通量测序技术, 对虎龙杂交斑和斜带石斑鱼肠道微生物群落进行解析, 探究两种石斑鱼肠道微生物组成与功能上的差异。本研究将为石斑鱼肠道微生物与性状关联研究提供理论基础,为选择合适的石斑鱼养殖品种提供参考, 进而提高石斑鱼养殖业的经济效益。

1 材料与方法

1.1 样品采集

虎龙杂交斑[(47.47±5.92) g]和斜带石斑鱼[(43.26±2.33) g]购自广东省海洋渔业试验中心。在解剖前, 使用250 mg/L 丁香酚(生工生物, 中国)将鱼麻醉。使用75%乙醇对鱼表面消毒, 用无菌解剖工具无菌解剖,打开腹腔, 取鱼的全肠, 去除表面附着物。随后, 将肠道置于无菌2 mL 离心管中, 立即用液氮冷冻并保存于-80 °C, 直至提取DNA。每种鱼各5 个重复。

1.2 16S rDNA 的提取及测序

使用细菌基因组DNA 提取试剂盒(诺唯赞, 中国)提取细菌基因组DNA, 利用Thermo NanoDrop One(Thermo Fisher Scientifif, USA)检测DNA 的纯度与浓度。

以基因组DNA 为模板, 使用带标签序列的特异引物(515 F: GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 和806R:GGAC-TACHVGGGTWTCTAAT)及 TaKaRa Premix Taq®Version 2.0 (TaKaRa Biotechnology Co., China)通过PCR 扩增16S rDNA V4 区。

PCR 反应条件如下: 94 °C 5 min; 94 °C 30 s,52 °C 30 s, 72 °C 30 s, 30 个循环; 72 °C 10 min。按照NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®(New England Biolabs, USA)标准流程进行建库操作, 使用Illumina Nova 6000 平台对构建的扩增子文库进行PE250 测序(广东美格基因科技有限公司, 中国)。

1.3 生物信息学分析

使用fastp (https://github.com/OpenGene/fastp)和cutadapt (https://github.com/marcelm/cutadapt/) 处理Paired-end Raw Reads 得到质控后的paired-end Clean Reads。利用 usearch-fastq_mergepairs (http://www.drive5.com/usearch/)拼接paired-end Clean Reads 以获得Raw Tags。利用fastp (https://github.com/OpenGene/fastp)对Raw Tags 进行质量过滤得到Clean Tags。

使用UPARSE 将相似度≥97%的Clean Tags 分配到相同的操作分类单元(OTU) (Edgar, 2013)。随后,利用usearch-sintax 将每个OTU 的代表序列与SILVA数据库进行比对获得物种注释信息。利用Mothur 生成稀释曲线并计算Alpha 多样性指数, 包括Chao1 指数、Robbins 指数、Shannon 指数和Simpson 指数。采用Kruskal-Wilcox 检验计算各组间Alpha 多样性指数的显著性差异。Beta 多样性使用非度量多维尺度分析(NMDS)进行可视化(Cuietal, 2018)。采用线性判别分析(LDA)差异大小(LEfSe)法(http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse)对虎龙杂交斑和斜带石斑鱼肠道微生物进行鉴定, 以揭示标志微生物。LEfSe 方法使用Kruskal-Wallis 秩和检验检测各组的显著性差异丰度特征, 并使用归一化的相对丰度矩阵进行LDA以估计每个特征。饼图及百分比堆积图使用Origin 2018 (OriginLab, USA)进行绘制。

1.4 网络分析及功能预测

采用网络分析评价肠道中微生物群落之间的相互作用(Zhouetal, 2021)。基于细菌类群间的Spearman 相关系数, 建立了微生物群落的相关性网络, 构建网络的标准为r＞0.6 和p＜0.05。使用Gephi 软件进行网络可视化。

采用基于未观察状态重建的群落系统发育研究(PICRUSt)预测微生物群落的功能。对16S rRNA 基因拷贝数进行归一化后, 参考京都基因和基因组百科全书(KEGG)同源性(KO)数据库预测微生物区系功能(Maetal, 2019)。使用主成分分析(PCA)对肠道微生物区系功能多样性进行可视化。

2 结果

2.1 16S rDNA 测序数据及Alpha 多样性分析

通过将测序所获得的序列进行筛选和聚类, 共获得1 952 个操作分类单元(OTUs)。虎龙杂交斑样品含有1 568 个OTUs, 斜带石斑鱼样品含有1 283 个OTUs。二者有共同899 个OTUs, 虎龙杂交斑特有669个OTUs, 斜带石斑鱼特有384 个OTUs (图1a)。稀释曲线显示, 各曲线随着序列数的增加而趋于平缓,说明测序深度足以提供样品中所有微生物的信息(图1b)。Alpha 多样性结果显示, 虎龙杂交斑肠道微生物的Chao1 指数高于斜带石斑鱼, 但无显著性差异(P＞0.05),Simpson 指数则显著高于斜带石斑鱼(P＜0.05); 斜带石斑鱼肠道微生物的Robbins 指数、Shannon 指数高于虎龙杂交斑, 差异不显著(P＞0.05, 表1)。

表1 虎龙杂交斑和斜带石斑鱼肠道微生物群落的Alpha多样性指数Tab.1 The Alpha diversity of gut microbes from hybrid grouper and orange-spotted grouper

图1 虎龙杂交斑和斜带石斑鱼肠道微生物OTU 数目和稀释曲线Fig.1 OTU number and dilution curve of gut microbes of hybrid grouper and orange-spotted grouper

2.2 肠道微生物群落组成

在两种石斑鱼肠道中共鉴定出7 个主要的门类(相对丰度＞0.1%)和21 个属类(相对丰度＞0.1%), 优势门类为变形菌门(Proteobacteria, 68.14%)、厚壁菌门(19.18%)和梭杆菌门(Fusobacteria, 10.00%) (图2); 优势属类为弧菌属(Vibrio, 45.26%)、罗姆布茨菌属(Romboutsia,13.50%)和鲸杆菌属(Cetobacterium, 9.99%) (图3)。

图2 石斑鱼肠道微生物在门水平的组成(相对丰度＞0.1%)Fig.2 Composition of gut microbes of grouper at the phylum level (relative abundance ＞ 0.1%)

图3 石斑鱼肠道微生物在属水平的组成(相对丰度＞0.1%)Fig.3 Composition of gut microbes of grouper at the the genus level (relative abundance ＞ 0.1%)

在虎龙杂交斑中, 变形菌门(63.89%)和厚壁菌门(32.65%)是其肠道中的优势门类, 而在斜带石斑鱼肠道中为变形菌门(73.72%)和梭杆菌门(22.72%) (图4a)。在属类水平中, 虎龙杂交斑的优势属类为弧菌属(52.39%)、罗姆布茨菌属(24.74%)和狭义梭菌属1 (Clostridium sensustricto1, 5.94%), 斜带石斑鱼的优势属类为弧菌属(40.04%)、鲸杆菌属(22.71%)和发光杆菌属(Photobacterium, 15.00%) (图4b)。

图4 虎龙杂交斑和斜带石斑鱼的肠道微生物组成Fig.4 Composition of gut microbes of hybrid grouper and orange-spotted grouper

与虎龙杂交斑相比, 斜带石斑鱼肠道中梭杆菌门、鲸杆菌属和发光杆菌属的相对丰度显著更高(P＜0.05,图4c)。LEfSe 分析表明, 鲸杆菌属、发光杆菌属以及丙酸菌属(Propionigenium)是斜带石斑鱼肠道中的标志微生物, 虎龙杂交斑肠道中的标志微生物为狭义梭菌属7 (Clostridiumsensustricto7)、棒状杆菌属1(Corynebacterium1)和瘤胃菌属(Ruminococcaceae UCG008)。

与斜带石斑鱼不同, 虎龙杂交斑三个标志性属类的相对丰度较低, 且其肠道内的标志微生物源自更多不同的分类分支(图5)。此外, NMDS 显示虎龙杂交斑和斜带石斑鱼肠道微生物群落基本分离(图6)。

图5 虎龙杂交斑和斜带石斑鱼的LDA 得分图(a)和LEfSe 分支图(b)Fig.5 Histogram of the LDA scores (a) and the LEfSe cladogram (b) of hybrid grouper and orange-spotted grouper

图6 虎龙杂交斑和斜带石斑鱼的非度量多维尺度分析Fig.6 Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analysis of gut microbes of hybrid grouper and orange-spotted grouper

2.3 肠道微生物群落的共现网络分析

采用微生物相关性网络分析, 评估肠道微生物群落的相互作用。虎龙杂交斑肠道中微生物的相互作用以一个模块为主, 而斜带石斑鱼中包含多个孤立模块(图7a, 7b)。据图7c、图7d 可见, 变形菌门主导着两种石斑鱼的肠道微生物网络。此外, 厚壁菌门也在虎龙杂交斑肠道微生物网络中发挥着较重要的作用(图7c)。

图7 虎龙杂交斑(a、c)和斜带石斑鱼(b、d)的肠道微生物共现网络Fig.7 Co-occurrence network of gut microbes in hybrid grouper (a, c) and orange-spotted grouper (b, d)

2.4 肠道微生物群落功能预测

PCA 显示, 虎龙杂交斑和斜带石斑鱼肠道微生物群落的功能基本分离。PCA 中, PC1 占总变异的77.9%, PC2 占总变异的10.7%, 两个PCA 轴解释了虎龙杂交斑和斜带石斑鱼肠道微生物群落之间88%以上的总变异(图8a)。

图8 虎龙杂交斑和斜带石斑鱼肠道微生物的预测功能Fig.8 The predicted function of gut microbes of hybrid grouper and orange-spotted grouper

图8b 展示了基于2 级KEGG 通路的微生物群落功能组成, 结果显示虎龙杂交斑和斜带石斑鱼肠道微生物群落的功能组成类似, 主要由碳水化合物、辅因子和维生素、氨基酸、萜类化合物与聚酮类化合物、其他氨基酸和脂类代谢组成, 占比将近60%。基于3级KEGG 通路, 本研究发现了两种石斑鱼肠道中具有显著差异的功能通路。抗坏血酸和糖醛酸代谢、植物-病原体相互作用和胰岛素信号通路在虎龙杂交斑肠道中显著更高, 而斜带石斑鱼中以万古霉素类抗生素和链霉素的生物合成、亚油酸代谢、双酚降解和类黄酮的生物合成通路显著更高(图8c, 表2)。

表2 虎龙杂交斑和斜带石斑鱼具有显著性差异的肠道微生物功能Tab.2 Significantly different functions of gut microbes between hybrid grouper and orange-spotted grouper

3 讨论

肠道微生物能够参与营养代谢并影响宿主免疫系统, 在宿主健康中发挥着重要的作用, 其组成受到环境因素、摄食和宿主遗传学的影响(O'Haraetal,2006; Marquesetal, 2010; Zhangetal, 2019; Lietal,2023)。肠道微生物的比较分析在疾病防控(Daietal,2020; Wuetal, 2021b; Mondaletal, 2022)、环境适应(Linetal, 2022)以及摄食管理(Pengetal, 2019;Salas-Leivaetal, 2020)方面具备重要意义, 相关研究在林氏异腕虾(Heterocarpushayashi)、长鳍鰤 (Seriola rivoliana)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、黄鳝(Monopterusalbus)及克氏原螯虾(Procambarusclarkia)中均有报道, 但对石斑鱼肠道微生物群落的研究甚少。本研究对两种具有重要经济价值的养殖石斑鱼品种的肠道微生物群落进行了表征, 并对其共现模式和预测功能进行了探究。

以往许多研究表明, 变形菌门和厚壁菌门在海洋鱼类肠道微生物群落中占主导地位(Dongetal,2020; Johnyetal, 2022; Yuetal, 2022)。本研究结果显示, 石斑鱼肠道微生物群落的优势门类为变形菌门、厚壁菌门以及梭杆菌门, 与花斑刺鳃 鮨(Plectropomusleopardus)、虹鳟鱼(Oncorhynchusmykiss)、军曹鱼(Rachycentroncanadum)、尖吻鲈(Latescalcarifer)和布氏 鲳鲹 (Trachinotusblochii)的结果相一致(Michlet al, 2017; Rasheedaetal, 2017; Mekuchietal, 2018)。但两种石斑鱼肠道的优势门丰度有所不同, 两种石斑鱼肠道中变形菌门的相对丰度最高; 其次, 在虎龙杂交斑中相对丰度较高的门是厚壁菌门(32.65%)和放线菌门(1.03%), 在斜带石斑鱼中则是梭杆菌门(22.72%)和厚壁菌门(2.49%)。两个石斑鱼品种肠道微生物群落中门水平相对丰度的差异, 表明肠道微生物群落的组成可能与宿主的遗传背景相关。Li 等对四种重要经济亚洲鲤鱼的肠道微生物群落的研究揭示了亚洲鲤鱼肠道微生物群落结构的影响因素, 其研究表明, 即使不同的物种生存在同一环境中, 各物种的肠道微生物群落仍具有物种特异性(Lietal, 2018)。对匙吻鲟(Polyodonspathala)和鳙鱼(Aristichthysnobilis)的研究也得出了类似的结果, 宿主遗传背景可能是导致同一养殖环境中摄食相似的养殖物种肠道微生物群落存在差异的主要因素(Lietal, 2014)。

值得注意的是, 在属水平上, 两个石斑鱼品种均以弧菌属为相对丰度最高的属。在大西洋鳕(Gadusmorhua)、凡纳滨对虾、军曹鱼和布氏鲳 鲹等养殖物种中也曾观察到较高的弧菌属丰度(Reidetal, 2009;Rasheedaetal, 2017; Zoqrattetal, 2018)。弧菌属常作为具有巨大影响力的致病菌而广受关注, 副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和哈维弧菌(V.harveyi)等常见的弧菌属致病菌可引起海洋鱼类和贝类严重疾病(Ina-Salwanyetal, 2019;Trigaetal, 2023)。早期的数据显示, 石斑鱼易受弧菌属感染(Ina-Salwanyetal, 2019)。在本研究中, 石斑鱼肠道中含有较高丰度的弧菌属却未见疾病的发生,可能与弧菌属致病菌的条件致病性以及弧菌属存在潜在益生菌相关(Thompsonetal, 2004; Egertonetal,2018; Zhuetal, 2023)。Ringø 等已分离出能够大量产生二十碳五烯酸的海弧菌(Vibriopelagius) (Ringøet al, 1992), Zhu 等(2023)则已分离出可作为饲料添加剂增强宿主免疫能力的河流弧菌(Vibriofluvialis) (Zhuetal, 2023)。此外, 也有研究表明, 弧菌属可以分泌淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶和几丁质酶, 帮助宿主消化体内的营养物质, 如脂肪、蛋白质和碳水化合物(Hansenetal, 1999)。总而言之, 弧菌属在石斑鱼肠道中的作用机制仍有待进一步研究。

斜带石斑鱼肠道中的鲸杆菌属及发光杆菌属相对丰度较高, 与虎龙杂交斑相比差异显著, 是LEfSe证实的肠道标志微生物。已有报道显示, 鲸杆菌属具有产生维生素B12的能力, 并且对鱼类的葡萄糖稳态具有有益作用(Wangetal, 2021; Zhangetal, 2022a)。维生素B12在DNA 合成与调节、神经系统功能、红细胞形成等生物过程中至关重要。发光杆菌属则与弧菌属相同, 是具有生产多不饱和脂肪酸能力的主要微生物之一(Moietal, 2018)。虎龙杂交斑肠道中相对丰度较高的属与标志微生物不相一致, 相对丰度较高的罗姆布茨菌属可能在维持宿主肠道健康状况方面发挥关键作用(Mangifestaetal, 2018)。罗姆布茨菌属主要利用单糖和双糖形成乙酸、甲酸和乳酸, 通过上调或下调多种代谢产物以达到调控宿主免疫功能的作用(Songetal, 2022)。另一相对丰度较高的狭义梭菌属 1 则被认为能够抑制条件致病性埃希菌属(Escherichia)细菌(Liangetal, 2023)。

虎龙杂交斑肠道中的标志微生物棒状杆菌属1、变形杆菌属(Proteus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)以及类香菌属(Myroides)值得关注, 人们通常将其视为致病菌(Hamiltonetal, 2018; Ningetal, 2020; Beathardetal, 2021; Lisowska-Łysiaketal, 2021)。虎龙杂交斑具备的较强抗病性可能是本研究中未出现疾病或死亡的原因(Tanetal, 2018)。值得注意的是, 一些研究显示上述菌属的物种在病原菌抑制、水体净化、宿主保护等方面也存在一定的功效, 可能有助于虎龙杂交斑抗病能力的增强(Nayaketal, 2011; Hamzaetal,2018; Apines-Amaretal, 2022)。此外, 共现网络显示,棒状杆菌属1 和类香菌属是网络中主要模块的重要组成部分, 变形杆菌属及葡萄球菌属则起到连接模块的作用, 它们的生长与代谢受到其他各类微生物的影响, 这可能使其稳定在一定水平而不致引起相关疾病。因此, 该四种菌属的有益功能可能是通过连接及丰富微生物网络, 使虎龙杂交斑肠道微生物群落更加复杂, 帮助虎龙杂交斑适应更广泛的生存环境(Pengetal, 2019)。总之, 虎龙杂交斑肠道标志微生物与宿主生理之间的关系值得进一步探索。

PICRUSt 通过将测序数据与参考基因组进行比较来预测微生物群落的功能潜力(Langilleetal, 2013)。根据预测, 最丰富的功能类别是与碳水化合物、辅因子和维生素以及氨基酸代谢相关的功能类别, 虎龙杂交斑与斜带石斑鱼的KEGG 通路存在显著差异。在虎龙杂交斑肠道中, 抗坏血酸和糖醛酸代谢与胰岛素信号通路更为丰富。抗坏血酸和糖醛酸代谢是抗氧化防御相关途径的组成部分, 参与超氧化物的清除, 有助于增强免疫系统(Bietal, 2023)。此外, 抗坏血酸在提高存活率和生长性能方面也具有一定的作用(Liaoetal, 2023)。在鱼类中, 胰岛素信号通路参与葡萄糖摄取和糖原、脂质与蛋白质的合成, 在调节细胞生长和分化方面具重要意义(Jiaetal, 2022)。因此,虎龙杂交斑肠道中上述两个通路的富集可能会进一步增强其生长表现和抗病性。不同的是, 在斜带石斑鱼中, 与亚油酸代谢、双酚降解相关的KEGG 通路显著富集。亚油酸是鱼类必需的膳食营养素(Glencross,2009), 而接触双酚化合物(BPs), 包括双酚A (BPA)、双酚AF (BPAF)、双酚F (BPF)和双酚S (BPS)等可能会对水生脊椎动物的发育、生殖和性别比例产生影响(Jiaoetal, 2010; Zhangetal, 2022b; Huangetal,2023)。值得注意的是, 在斜带石斑鱼肠道中万古霉素类抗生素和链霉素的生物合成以及类黄酮生物合成相关通路也被显著富集, 这些通路均与抗菌相关, 可能会增加肠道微生物群对病原菌的抑制能力。然而,由于功能通路分析是根据微生物群落预测的, 因此需要进一步分析以确定肠道微生物的功能。

4 结论

本研究揭示了虎龙杂交斑和斜带石斑鱼肠道微生物的组成及功能差异。在两种石斑鱼肠道中变形菌门、厚壁菌门和梭杆菌门占主导地位。在属水平, 丰度较高的鲸杆菌属和发光杆菌属是斜带石斑鱼肠道中的标志微生物, 虎龙杂交斑肠道标志微生物为相对丰度较小的棒状杆菌属1、变形杆菌属、葡萄球菌属和类香菌属, 该四种菌属的作用可能是增加肠道微生物群落的复杂性, 进而增强虎龙杂交斑的环境适应性。功能预测显示, 肠道微生物群可能与虎龙杂交斑较好的生长表现以及抗病性相关, 而斜带石斑鱼需要肠道微生物参与亚油酸代谢、双酚降解以及抗菌物质合成。总的来说, 本研究支持了肠道微生物群落结构与宿主遗传背景相关的观点, 加深了对养殖石斑鱼肠道微生物群落的认识, 为后续的宿主相关益生菌筛选、养殖品种选择提供了参考。