肝豆补肾汤通过抑制铁死亡和内质网应激改善肝豆状核变性模型TX小鼠卵巢组织损伤

刘千琢,韩 辉,房新如,王路遥,赵 丹,吴丽敏

(1.安徽中医药大学第一附属医院,安徽 合肥 230031;2.中国科学技术大学附属第一医院生殖中心,安徽 合肥 230001)

肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration,HLD)是一种由ATP7B基因突变引起的常染色体隐性遗传性疾病[1]。患者铜代谢障碍,过量的铜沉积在机体,常表现为肝、脑等全身多器官损害[2]。近年来,HLD合并生殖系统损害的报道逐渐增多,女性HLD患者常伴有月经不调、闭经及自然流产等表现[3]。因此,对HLD生殖功能损害的关注是十分必要的。

铁死亡是一种铁依赖性调节性细胞死亡,由大量脂质过氧化物介导的膜损伤引起。铁死亡与多囊卵巢综合征、卵巢功能不全和自然流产等多种女性生殖障碍相关[4]。最近研究[5]发现,铁死亡常参与铜诱导的精子发生障碍。铁死亡涉及HLD[6-7],而HLD患者体内也存在铁过载[8]及氧化和(或)抗氧化失衡等[9],因此,调控铁死亡可能是缓解和治疗HLD的有效手段。内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激是一种保护性应激反应,但持续的ER应激也会导致细胞死亡[10]。研究[11]发现,过度的ER应激会对卵子的生成产生负面影响,并诱导多种生殖系统疾病的发生。此外,ER应激与铁死亡的发生密切相关[12]。同时,研究[13]发现,铜诱导的毒性作用与ER应激密切相关。然而,铁死亡和ER应激是否参与HLD患者铜暴露引起的卵巢损害目前尚不清楚。

青霉胺等铜螯合剂仍然是目前治疗HLD的主要药物[14],但其常伴有过敏和免疫损伤等不良反应。传统中药具有全面调节身体功能、不良反应小等优点。肝豆补肾汤是基于HLD痰瘀互结病机和“肾主生殖”理论研制而成的中药方剂。临床研究[15]结果表明,该方有助于HLD月经不调患者优势卵泡发育,刺激雌二醇和孕酮分泌,改善HLD患者的月经紊乱情况。本实验以TX小鼠作为HLD模型,观察肝豆补肾汤对TX小鼠卵巢损害的保护作用,探究TX小鼠铜代谢障碍引起卵巢损害的可能机制。

1 材料

1.1 动物 30只C3He-ATP7btx-j小鼠采购于美国Jackson实验动物中心,编号 40886617,10只正常对照组小鼠采用DL同系对照小鼠。实验动物使用许可证号:SYXK(皖)2022-005。所有研究方案均经过安徽中医药大学动物实验伦理委员会审查(批准号:2014030311)。小鼠在每天光照12 h和黑暗12 h的环境下饲养,动物房温度18～20 ℃,湿度50%～60%,自由采食、饮水。

1.2 药物 肝豆补肾汤(丹参20 g,黄连、莪术、姜黄、鸡血藤、杜仲、枸杞子、熟地黄、益母草、当归各10 g,菟丝子、大黄、淫羊藿各6 g,均为颗粒剂,由广东一方制药有限公司提供)购于安徽中医药大学第一附属医院,临用时配置成1.3 g/mL的药液。青霉胺片(上海上药信谊药厂有限公司,国药准字 H31022286)。

1.3 主要试剂 前列腺素过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)抗体(批号 GR3210900-1):美国Abcam公司;谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)抗体(批号 AB10101745)、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)抗体(批号 AD19205601)、磷酸化蛋白激酶核糖核酸样内质网激酶(phosphorylated protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,p-PERK)抗体(批号 9)、磷酸化真核起始因子2α(phosphorylated eukaryotic initiation factor 2 alpha-subunit,p-eIF2α)抗体(批号 AG19260018)、活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)抗体(批号 AH19026512):北京Bioss公司;PERK抗体(批号 11)、eIF2α抗体(批号 7):美国CST公司;C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP;批号 CJ36131):南京巴傲得生物科技有限公司;甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH;批号 200040908):北京Zsbio公司;血清铁测定试剂盒(批号 A039-1-1)、脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)测定试剂盒(批号 A003-1)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)及氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)测定试剂盒(批号 A061-1):南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 分组及给药 将30只TX小鼠随机分为HLD组、青霉胺组和肝豆补肾汤组,每组10只。肝豆补肾汤组按1.5 g/(kg·d)灌胃给药,青霉胺组按0.1 g/(kg·d)灌胃给药,HLD组和正常对照组给予等容量生理盐水灌胃。小鼠用药量均相当于成人临床用药量的9倍。各组小鼠均于每日上午9:00灌胃,每日1次,共28 d。

2.2 标本采集与处理 末次给药后第2日上午9:00—10:00,各组小鼠均给予10 IU孕马血清促性腺激素,24 h后,每组取4只小鼠注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行麻醉。取左侧卵巢置于甲醛中,用于苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,将右侧卵巢置于戊二醛溶液中以备用于透射电子显微镜观察。注射孕马血清促性腺激素48 h后,予每组其余6只小鼠腹腔注射10 IU人绒毛膜促性腺激素。间隔14 h后,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,从眼部取血,离心,取血清,置于-80 ℃冰箱中。随后,脱颈法处死小鼠,取出双侧卵巢,采用1 mL针头将小鼠输卵管壶腹刺破,使卵泡排入体外培养液,在显微镜下计数,并将卵巢组织保存于-80 ℃冰箱。

2.3 卵巢系数评估 所有小鼠在麻醉前称质量,麻醉后立即取出双侧卵巢,经生理盐水冲洗、滤纸吸干后称质量,计算卵巢系数。小鼠卵巢系数=双侧卵巢质量/小鼠体质量×100%。

2.4 光学显微镜下观察卵巢组织形态 剥离小鼠卵巢组织,在多聚甲醛溶液中固定36 h,石蜡包埋,连续切片。HE染色后,光学显微镜下观察卵巢组织结构及小鼠卵泡生长情况,并对各级卵泡进行计数。

2.5 透射电子显微镜下观察卵巢组织的超微结构 取1 mm3卵巢组织块,经戊二醛固定、梯度脱水、石蜡包埋,再于烘箱内固化,然后进行超薄切片。在透射电子显微镜下观察卵巢组织的超微结构。

2.6 血清铁含量及卵巢组织中GSH、GSSG、MDA含量测定 采用比色法测定血清中铁含量,采用硫代巴比妥酸法检测卵巢组织中MDA含量,采用微量酶标法检测卵巢组织中GSH及GSSG水平。

2.7 Western blot法测定卵巢组织中PTGS2、GPX4、GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平 用RIPA细胞裂解缓冲液裂解卵巢组织,匀浆后提取总蛋白。根据TRAKRA产品目录配置凝胶。将5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液以1∶4的比例添加至所收集的蛋白样品中,在沸水浴中使蛋白质完全变性,再将蛋白质样品加入SDS-PAGE胶中,在80 V电压下电泳,蛋白分离后采用200 mA电流转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉密封后,在室温下放置2 h。根据制造商提供的参考浓度将PVDF膜与特异性一抗在4 ℃下孵育过夜。洗涤后,将蛋白膜与偶联有HRP的二抗在室温下孵育1.2 h。最后,使用ECL plus蛋白质印迹检测系统检测蛋白质,使用Image J软件(版本号 v1.8.0,美国国立卫生研究院)分析蛋白质水平。

3 结果

3.1 4组小鼠体质量、卵巢质量、卵巢系数比较 与正常对照组比较,HLD组小鼠卵巢质量显著降低(P<0.05);与HLD组比较,肝豆补肾汤组和青霉胺组小鼠体质量、卵巢质量、卵巢系数均有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。

表1 4组小鼠体质量、卵巢质量及卵巢系数比较

注:A.正常对照组;B.HLD组;C.青霉胺组;D.肝豆补肾汤组

3.2 4组小鼠促排卵后排卵数比较 与正常对照组比较,HLD组小鼠排卵数显著降低(P<0.05);与HLD组比较,青霉胺组和肝豆补肾汤组小鼠排卵数显著增加(P<0.05);肝豆补肾汤组与青霉胺组排卵数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 4组小鼠促排卵后排卵数比较

3.3 4组小鼠卵巢组织形态比较 正常对照组小鼠各级卵泡发育正常,其中卵母细胞呈圆形,颗粒细胞在周围包绕,排列整齐;HLD组小鼠卵母细胞核固缩,细胞质溶解,透明带塌陷、断裂,颗粒细胞层减少,闭锁卵泡增加;青霉胺组小鼠次级卵泡和窦状卵泡形态明显改善;肝豆补肾汤组小鼠次级卵泡和窦状卵泡发育正常,颗粒细胞排列紧密,卵泡形态与正常对照组接近。见图2。

注:A.正常对照组;B.HLD组;C.青霉胺组;D.肝豆补肾汤组;E、F、G、H分别为A、B、C、D方框内放大部分

3.4 4组小鼠卵巢超微结构比较 HLD组小鼠卵巢出现线粒体明显皱缩、嵴断裂和嵴减少等典型铁死亡表现,并出现ER肿胀、部分脱颗粒等ER应激现象;与HLD组比较,肝豆补肾汤组和青霉胺组小鼠卵巢线粒体铁死亡表现和ER应激现象显著改善,形态接近正常对照组。见图3。

注:A.正常对照组;B.HLD组;C.HLD组;D.青霉胺组;E.肝豆补肾汤组;F、G、H、I、J分别为A、B、C、D、E方框内放大部分;A、B、C、D、E中标尺示2 μm,F、G、H、I、J中标尺示500 nm;红色箭头指向异常线粒体,蓝色箭头指向异常ER

3.5 4组小鼠血清铁及卵巢组织中MDA、GSH、GSSG表达水平比较 与正常对照组比较,HLD组小鼠血清铁及卵巢组织中MDA、GSSG水平显著升高(P<0.05),卵巢组织中GSH水平和GSH/GSSG显著降低(P<0.05);与HLD组比较,青霉胺组、肝豆补肾汤组小鼠血清铁及卵巢组织中MDA、GSSG水平显著降低(P<0.05),卵巢组织中GSH水平和GSH/GSSG显著升高(P<0.05)。肝豆补肾汤组与青霉胺组上述指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见图4。

注:A.正常对照组;B.HLD组;C.青霉胺组;D.肝豆补肾汤组;与正常对照组比较,*P<0.05;与HLD组比较,#P<0.05

3.6 4组小鼠卵巢组织PTGS2、GPX4蛋白表达水平比较 与正常对照组比较,HLD组小鼠卵巢组织PTGS2表达水平显著升高(P<0.05),GPX4表达水平显著降低(P<0.05);与HLD组比较,青霉胺组和肝豆补肾汤组PTGS2表达水平显著降低(P<0.05),GPX4表达水平显著升高(P<0.05)。与青霉胺组比较,肝豆补肾汤组PTGS2表达水平显著降低(P<0.05),GPX4表达水平显著升高(P<0.05)。见图5。

注:A.正常对照组;B.HLD组;C.肝豆补肾汤组;D.青霉胺组;与正常对照组比较,*P<0.05;与HLD组比较,#P<0.05;与肝豆补肾汤组比较,△P<0.05

3.7 4组小鼠卵巢组织GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平比较 与正常对照组比较,HLD组小鼠卵巢组织GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与HLD组比较,青霉胺组卵巢组织GRP78、p-PERK、p-eIF2α表达水平显著降低(P<0.05),肝豆补肾汤组GRP78、p-PERK、p-eIF2α、CHOP表达水平均显著降低(P<0.05)。见图6。

4 讨论

HLD是由于基因突变导致P型ATP7B酶功能或含量异常,使铜无法与铜蓝蛋白前体蛋白结合形成铜蓝蛋白,导致游离铜增多、铜代谢紊乱,进而造成肝、脑等全身多器官损伤的代谢性疾病。越来越多的研究报道了铜暴露对生殖功能的损害[16]。女性生殖功能异常在HLD患者中很常见。

肝豆补肾汤由大黄、黄连、莪术、姜黄、丹参、鸡血藤、杜仲、枸杞子、熟地黄、菟丝子、淫羊藿、益母草和当归组成,是临床治疗HLD合并生殖功能异常常用的经验方,疗效较好[15,17]。课题组前期研究[18]发现,肝豆补肾汤可以提高铜负荷小鼠的排卵数,促进卵泡发育,改善线粒体结构,提升卵丘复合物颗粒细胞的增殖能力。同时,现代研究证实,杜仲、菟丝子、熟地黄、淫羊藿及枸杞子可以调节人体下丘脑—垂体—性腺轴的功能,促进促卵泡激素及促黄体生成素的分泌,改善卵巢及子宫血液供应,从而促进卵泡发育。在本实验中,经肝豆补肾汤干预后,卵巢组织结构破坏减轻,闭锁卵泡数量减少,排卵率有所提高,这提示肝豆补肾汤对TX小鼠卵巢组织具有保护作用。

铁死亡是近期发现的一种细胞死亡方式,是铁依赖性脂质过氧化反应[19]。最近研究[5]表明,铜可以通过诱导铁死亡的发生而起到不利作用。PTGS2是铁死亡的重要生物标志物。GSH是细胞中重要的抗氧化剂,在扫除脂质自由基中起关键作用。铁死亡诱导剂erastin可以通过抑制SLC7A11阻碍GSH的合成[20]。同时,GSH还是GPX4发挥作用的关键因子。GPX4是一种硒蛋白,其通过抑制脂质过氧化、清除脂质过氧化物维持细胞内氧化还原稳态[21],GPX4下调通常是铁死亡发生的关键因素。此外,铁沉积、脂质过氧化是铁死亡的重要特征[22-23]。铁死亡是铁依赖性的细胞死亡方式,铁含量是铁死亡发生的重要条件。脂质过氧化属于生物体氧化还原系统的失衡,在铁死亡发生过程中起到主要的驱动作用,可以通过破坏细胞膜的磷脂双分子层结构及脂质过氧化产物MDA等的细胞毒性作用诱发铁死亡[24]。本研究中,HLD组小鼠卵巢组织中PTGS2表达水平显著增加,GPX4表达水平显著降低,血清铁及卵巢组织中MDA、GSSG表达水平明显增加,而卵巢组织中GSH表达水平显著降低。经肝豆补肾汤和青霉胺干预后PTGS2表达水平降低,GPX4表达水平升高,血清铁及卵巢组织中MDA、GSSG水平显著降低,卵巢组织中GSH消耗显著减少。结果表明,TX小鼠体内铜代谢障碍可诱导其卵巢组织铁死亡的发生,而肝豆补肾汤可以减少小鼠铁含量,改善脂质过氧化物产物堆积,恢复抗氧化系统功能,从而抑制卵巢组织的铁死亡。

机体在应激状态下会发生ER应激,这是一种保护性反应,但应激持续产生或程度加剧也会引起细胞死亡。ER应激与铁死亡联系密切,在各种因素诱导的铁死亡过程中,ER应激也增加[25]。Xu等[26]发现,ER应激是导致溃疡性结肠炎结肠上皮细胞铁死亡的诱发因素。PERK介导的ER应激与铁死亡关系密切。而铜造成的细胞毒性也与该通路介导的ER应激有关[27]。研究[28]表明,机体在受到刺激等异常情况下,PERK会与GRP78分开,发生自磷酸化,并进一步活化下游转录因子,包括eIF2α、ATF4和CHOP。本研究结果显示,TX小鼠卵巢组织中PERK介导的ER应激通路上相关蛋白表达水平均升高,且电子显微镜下可见TX小鼠卵巢细胞ER肿胀、脱颗粒等ER应激表现。而青霉胺和肝豆补肾汤干预后,PERK介导的ER应激通路上相关蛋白表达水平均降低。结果表明,铜暴露能诱导ER应激的发生,肝豆补肾汤能抑制铜诱导的ER应激。

综上所述,TX小鼠铜代谢障碍可以诱导卵巢组织损伤,其机制可能与铜沉积诱导铁死亡与ER应激有关,而肝豆补肾汤可以通过抑制铁死亡和PERK通路介导的ER应激发挥保护作用。本研究显示,肝豆补肾汤改善某些指标的作用优于青霉胺,这可能是因为肝豆补肾汤中多种药效成分通过多途径、多靶点协同作用于机体,其疗效优于仅具有排铜作用的青霉胺。今后可应用相关抑制剂对卵巢组织细胞进行体外实验,以深入探索铁死亡与ER应激之间的联系。