超高效液相色谱-串联质谱法测定水质中多肽类抗生素

吴庆阳

（必维申美商品检测有限公司，上海 201108）

引言

多肽类抗生素指具有多肽结构，即三个及以上氨基酸分子脱水缩合结构，一小部分肽类抗生素呈线状的，其余大多是环状化合物。在多肽类抗生素中，不同的抗生素所具有的抗菌作用不同，可分别对抗真菌、病毒、细菌等的感染，可治疗一些炎症和感染。通常使用小剂量来抑菌，使用大剂量来杀菌。使用多肽类抗生素，细菌不易产生耐药性，但是其毒性较大，主要会引起神经毒性和肾毒性，且不易被来自动植物体内的酶所水解。多肽类抗生素主要以原药、代谢产物等形式排出体外，然后通过生活污水、农业粪肥、养殖和制药企业废水等方式进入环境水体。近年来，在国内外的不同环境水体中均检出抗生素，这些残留的抗生素严重危害了生态系统，并可能在环境和生物体中累积或者通过食物链富集，使细菌产生抗生素抗性基因，严重威胁人类健康。进入环境水体的多肽类抗生素多以痕量浓度存在，且种类多、性质差别大，所以检测这些抗生素的难度也比较大，目前几乎没有水质中多肽类抗生素的检测方法。本研究拟采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定水质中11种多肽类抗生素，并利用固相萃取柱对样品进行萃取净化，从而实现对水质中多肽类抗生素的灵敏、快速、准确的检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

1.1.1 仪器

超高效液相色谱串联质谱仪，UPLC-Xevo TQ-S串联质谱，沃特世公司；涡轮混合器，QT-1，琪特公司；氮吹仪，TM112，联合公司；自动固相萃取仪，Fotector plus 60，含大体积进样装置，睿科公司；电子天平，XS105DU，梅特勒-托利多公司。

去甲万古霉素、万古霉素、粘杆菌素B、粘杆菌素A、杆菌肽B、杆菌肽A、恩拉霉素B、恩拉霉素A、太古霉素、维吉尼亚霉素M1、维吉尼亚霉素S1，Dr.E公司；乙腈、甲醇、甲酸和丙酮（色谱纯），飞世尔公司；盐酸（优级纯），黙克公司；固相萃取柱，Oasis HLB柱（6 mL/500 mg），沃特世公司；Na2EDTA（分析纯），国药公司；0.45 μm、0.22 μm滤膜，沃特世公司。

1.2 标准溶液的制备

1.2.1 标准储备溶液

1 000 mg/L的单标储备液：分别称取11种多肽类抗生素各标准品适量（标准物质的浓度折算后各抗生素的质量为10.0 mg），移入10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶液溶解抗生素和定容，配制成单个抗生素的标准储备液。

10 mg/L混合标准溶液：用1 mL移液枪分别准确移取11种多肽类抗生素单标储备液1 mL于同一个100 mL的容量瓶中，用0.1%的甲酸甲醇溶液定容至刻度。

1.2.2 标准曲线的配制

根据实验需要，标准曲线浓度点分别为0、2、5、10、20、50、100、200 μg/L，移取适量的10 mg/L混合标准溶液于容量瓶中，初始流动相定容。

1.3 样品前处理

准确移取经过0.45 μm微孔滤膜过滤后的水样1 000 mL，加入0.5 g的Na2EDTA，用超声振荡使其溶解，再用1 mol/L的盐酸调节pH值为3.0，备用；上样前，依次用10 mL甲醇、5 mL超纯水和5 mL的0.1%甲酸水溶液活化HLB柱；然后以8 mL/min流速抽取水样，经HLB柱收集目标物；用12 mL超纯水淋洗小柱，气推后依次用5 mL的0.1%甲酸甲醇和5 mL的甲醇以1 mL/min速率洗脱。收集的洗脱液在45 ℃下用氮气吹干，加初始比例流动相1 mL复溶，混匀，然后使用0.22 μm的滤膜过滤，并使用UPLC-MS/MS测试滤液。

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1.4 试验方法

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱：AQUITY UPLC BEH C18，规格2.1×100 mm，1.7 μm，流速300 µL/min，柱温：35 ℃，进样量：1 µL，0.1%甲酸水溶液作为水相流动相，0.1%甲酸乙腈作为有机相流动相；梯度洗脱条件如表1所示。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.4.2 质谱分析条件

离子源参数：ESI+离子源，电离源温度为150 ℃，脱溶剂温度为500 ℃，脱溶剂气流流速为1 000 L/h，锥孔气流速为150 L/h，毛细管电离电压为2.5 kV，用质谱多反应监测扫描，离子对等质谱参数如表2所示。

表2 定量定性离子质谱参数

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

2.1.1 水样pH值的选择

由于多肽类抗生素会与多种金属离子螯合，形成沉淀，所以在水样中加入Na2EDTA后，因为EDTA与金属离子的配位能力更强，可以通过螯合作用释放出多肽类抗生素，消除部分离子的抑制作用，有效降低了杂质的影响[1]，提高了测定的回收率，但pH值影响了金属离子与EDTA的配位。另外，大多数多肽类抗生素都含有氨基、羟基和羧基，显弱碱性，在弱酸性条件下比较稳定，需调节水样的pH值。因此，需要通过实验来考察pH值对多肽类抗生素测试的影响。

移取1 000 mL空白水样5份，加入适量多肽类抗生素混合标准溶液，配置抗生素浓度均为100 ng/L的加标试样，用0.1 mol/L盐酸溶液调节5份样品的pH值分别为2、3、4、5、6，其他条件不变，进行UPLC-MS/MS测定。测试结果表明各种多肽类抗生素的提取效率有显著差异。当pH值为6及以上时，多肽类抗生素回收率明显降低。当pH=3时，多肽类抗生素综合回收率为最佳。因此，选择pH=3时的水样进行HLB柱萃取净化。

2.1.2 HLB柱的选择

多肽类抗生素几乎都为极性物质，目前大多数文献中，多肽类抗生素测定都推荐使用HLB固相萃取柱。HLB固相萃取柱采用反相保留机理，吸附剂由亲水性物质和亲脂性物质两种单体按比例聚合而成，通过聚合物上的亚氨基加强对极性物质的保留，同时具有很好的水浸润性，故此类化合物在HLB具有较好的疏水相互作用，可基于反相作用原理得以保留，而且HLB柱的净化效果较之C18、混合型萃取柱有更好的回收和更强的除杂能力[2]。对于大体积样品，采用体积容量较大的6 mL/500 mg型Oasis HLB柱，可避免堵死HLB小柱现象，且能够节约时间。实验结果表明，采用HLB柱萃取净化，多肽类抗生素的回收率较高，且重复性好。

2.1.3 洗脱液的选择

选择甲醇、乙腈和丙酮三种试剂进行洗脱效果比较，结果表明，丙酮及乙腈仅对部分抗生素的洗脱效果好，对其余部分抗生素的洗脱效果不好；而甲醇对多肽类抗生素的洗脱能力较为平均，对多肽类抗生素的综合回收率较高，且基质效应少，故选择甲醇为洗脱溶剂。同时也对甲醇的洗脱体积进行了考察，实验结果表明，当洗脱体积大于10 mL后，多肽类抗生素的回收率无明显提高，同时通过实验发现，使用5 mL、0.1%的甲酸甲醇代替5 mL的甲醇洗脱，多肽类抗生素的回收率更佳，洗脱液选择5 mL、0.1%的甲酸甲醇和5 mL的甲醇。

2.1.4 氮吹温度的选择

HLB柱萃取净化后，通常需对目标化合物的洗脱液进行浓缩，以提高试样的富集倍数和测量的灵敏度。氮吹是常用的方法，该方法所需仪器操作简单，可批量处理样品，在测试中得到广泛运用。然而，氮吹过程中通常需要对溶液进行加热，以缩短浓缩时间，提高分析通量。但若加热温度过高，则可能引起热稳定性差的组分分解。因此，需要通过实验来考察氮吹温度对多肽类抗生素测试的影响。

移取1 000 mL的空白水样4份，加入适量多肽类抗生素混合标准溶液，得到4份多肽类抗生素含量均为100 ng/L的加标试样。经前处理及HLB柱萃取净化后，洗脱液分别于25 ℃、35℃、45 ℃、55 ℃进行氮吹至干，用初始流动相溶解并定容至1 mL，进样1 µL，进行UPLC-MS/MS上机测定。实验结果表明，在4种不同氮吹温度下，多肽类抗生素回收率温度的升高，呈现出先基本稳定后下降的趋势。氮吹温度为45 ℃时，得到的多肽类抗生素的回收率与25 ℃和35 ℃氮吹相近，但是考虑到25 ℃和35 ℃氮吹条件下，氮吹时间过长，影响实验效率；而当温度升高至55℃时，样品中的有些抗生素回收率明显下降，提示可能发生降解。因此，选择45 ℃作为最佳氮吹温度。

2.2 色谱-质谱分析方法的优化

2.2.1 色谱条件的优化

由于各种多肽类抗生素在水、甲醇和乙腈中的溶解度不同，相对而言，甲醇总体上的溶解度特性优于乙腈，能完全溶解更多类型的样品，但甲醇比乙腈更粘稠，会产生更高的柱压，且乙腈比甲醇有更高的洗脱能力，乙腈流动相的峰形更窄，分离度更高。在流动相中添加0.1%的甲酸，以增大多肽类抗生素在质谱中母离子的信号，同时甲酸可以使色谱柱内的硅胶硅醇基质子化，从而减弱了硅醇基与待测物的相互作用，减少了色谱峰拖尾，使得色谱峰的峰形更佳[3]。实验结果表明，相比甲醇，采用乙腈作为有机相时，11种多肽类抗生素的响应均较高。因此，流动相为0.1%的甲酸乙腈和0.1%的甲酸水溶液。

2.2.2 质谱条件的优化

多肽类抗生素是由氨基酸缩合而成的肽类物质，与高等动植物中具有激素功能的多肽和蛋白质不同，分子量比一般蛋白质小得多，几乎都在300～3 000间，平均在1 000左右，在进入一级质谱后易结合H+，从而产生带正电的单电荷离子或多电荷离子，所以适合于使用ESI正模式离子源。在实验过程中，应向仪器中注入100 μg/L的待测物混标在正离子条件下进行全扫描，选择响应值较高的离子作为母离子，并优化锥孔电压，使母离子能够达到最高的响应强度，同理进行二级扫描，以优化碰撞电压。在确定子离子对，其他一些仪器参数采用的是仪器推荐值。

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线、线性范围和检出限

按1.2.2所述，配制多肽类抗生素曲线，使用UPLC-MSMS进行分析。横坐标为多肽类抗生素各浓度点，纵坐标为色谱峰面积，建立各个抗生素标准工作曲线。多肽类抗生素线性方程和线性相关系数r2见表3。在2～200 μg/L的浓度范围内，11种多肽类抗生素标准曲线线性良好，其线性相关系数r2均大于0.998。移取1 000 mL的空白水样7份，加入多肽类抗生素混合标准溶液适量，得到7份多肽类抗生素含量均为1ng/L的加标试样。按照1.3样品前处理和1.4仪器工作条件进行分析，计算7份加标样品结果的标准偏差，其标准偏差的3.14倍值即为检出限。实验结果表明：11种多肽类抗生素检出限介于0.38～0.89 ng／L之间，均小于1 ng/L，故在标准曲线浓度范围内，多肽类抗生素线性关系良好，检出限都能满足现行测试的需求。

表3 平均加标回收率和RSD、标准曲线回归方程、相关系数r2

2.3.2 方法准确度和精密度

通过对水样中多肽类抗生素低、中、高浓度水平下的加标测试，计算平均回收率，对多肽类抗生素测试方法的准确度进行考察，并计算同浓度水平加标回收率间的相对标准偏差（RSD），对多肽类抗生素测试方法的精密度进行考察。移取1 000 mL空白水样为一份样品，共19份，一份作为基质样品，在其余样品中分别加入不同体积的多肽类抗生素高浓度标准液，配制成加标水平分别为高、中、低浓度的加标样品，6个平行样品一个浓度水平进行实验，按照实验部分的前处理方法对样品进行前处理操作，使用优化好仪器条件的UPLC-MSMS测试样品。11中多肽类抗生素同浓度水平间平均回收率和RSD结果见表3。由表3可见，在加标浓度为2、50、200 ng/L下，平均加标回收率在77.7%～98.1%之间，RSD在1.5%～14.2%之间，表明测试方法的精密度和准确度很好，都能够满足水质中测试11种多肽类抗生素含量的测试要求。

2.4 实际样品测定

为了考察该测试方法的适用性，采集了纺织企业废水、制药企业废水、养殖企业废水、地下水、地表水和生活饮用水共48个样品。按照测试方法的分析步骤测定11种多肽类抗生素含量，同时进行样品加标实验。结果显示，除了一家养殖企业废水中多粘菌素B有检出（为3.12 ng/L）外，其他纺织企业废水、制药企业废水、地表水、地下水和生活饮用水样品中均未检出多肽类抗生素，且48个样品的加标回收率均满足70%～120%之间，符合实际样品测试多肽类抗生素的要求。

3 结论

本方法选择UPLC-MS/MS进行水质中多肽类抗生素的测定，该仪器比常用的HPLC-MS/MS拥有更高的灵敏度和分辨率，以及更短的出峰时间和更高效的采集效率。通过实验优选水样的pH值和固相萃取柱。在流动相的选择中，选用了使多肽类抗生素在质谱中更易于质子化的0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液作为流动相。对二级质谱的定量离子和定性离子进行了优选，在此基础上，对UPLC-MS/MS的方法学进行验证，结果表明，11种多肽类抗生素标准曲线的线性关系良好，相关系数r2均大于0.998。检出限均小于1 ng/L，加标回收率在77.7%～98.1%之间，RSD在1.5%～14.2%之间。将已建立的方法应用于不同类型的48个水样测试，其中一个样品检出3.12 ng/L加标多粘菌素B，48个样品的加标回收率均在70%～120%间。因此，所建立的水质中多肽类抗生素的固相萃取UPLC-MS/MS测定方法，具有适用基质广泛，前处理方法相对简单，方法灵敏度高，检出限低，准确度高，重复性好等优点，适用于大规模样品的测试。