巨噬细胞与髓核细胞相互通讯在椎间盘退变中的作用

陈湘元 朱柏扬 胡安钰 林晓玲 王丹丹

椎间盘退变 (intervertebral disc degeneration，IVDD)是临床上引起下腰痛的主要原因，研究表明，IVDD 是一个由基因遗传、机械负荷、外伤和吸烟等多种因素引起的慢性过程[1-2]。在退变过程中，当髓核组织所处环境受到破坏时，细胞外基质 Ⅱ 型胶原蛋白、蛋白聚糖等合成减少，基质金属蛋白酶表达水平增高，髓核组织脱水，难以抵抗外界机械负荷，严重时椎间盘突出、压迫神经出现疼痛症状[1,3]。然而 IVDD 是一个复杂多变的过程，其相关分子生物学机制仍未能完全阐明。近年来巨噬细胞与髓核细胞在 IVDD 中的相互通讯及其分子机制受到较多的关注，笔者通过对巨噬细胞和髓核细胞相互通讯的分子机制进行归纳总结，以进一步深入了解 IVDD 的分子机制。

一、巨噬细胞和髓核细胞与 IVDD

髓核细胞可以表达 Fsa 配体 (fas ligand，Fasl) 诱导巨噬细胞等其它免疫细胞的凋亡，维持正常椎间盘免疫豁免的特征[4]。当椎间盘受到异常压力负荷后，严重超过其结构的抗压能力，导致纤维环的撕裂，血管从外层纤维环向髓核组织内生，打破了椎间盘免疫豁免状态，促使各类免疫细胞浸润到椎间盘组织中产生免疫炎症反应，发挥免疫系统的调控作用[5-6]。

IVDD 与炎症反应密切相关，炎症因子在椎间盘组织中发挥了关键的致病作用[7]。巨噬细胞是具有吞噬功能的免疫细胞，其表型可塑性和功能多样性使巨噬细胞在不同的微环境下产生相应的表型改变，其中主要包括：促炎反应的 M1 型和抗炎重塑的 M2 型[8]。巨噬细胞的极化与IVDD 高度相关，M1 与 M2 型巨噬细胞参与椎间盘组织损伤、修复愈合过程，维持椎间盘内部微环境的稳态[9]。随着退变程度的增加，髓核组织中组织驻留巨噬细胞占比逐渐升高[10]，组织内炎症因子表达水平增强，并在炎症因子的介导下免疫细胞趋化积聚使髓核组织微环境及生理功能遭到破坏，进一步促进 IVDD 发生发展[2,11]。巨噬细胞和髓核细胞间的相互通讯可以调控与 IVDD 发生发展过程中相关基因的表达，在炎症微环境中，这种调控作用与炎症因子的表达水平呈正相关，最终形成正反馈调节的恶性循环[12]。

二、巨噬细胞和髓核细胞的相互通讯

在巨噬细胞浸润椎间盘的过程中，巨噬细胞和退变髓核细胞自身可分泌促炎细胞因子[2,13]，有研究发现将巨噬细胞 -髓核细胞共培养后促炎细胞因子的含量明显增多[14]。退变椎间盘组织中，基质金属蛋白酶的高表达促使细胞外基质 Ⅱ 型胶原蛋白和蛋白聚糖表达水平显著降低，并且伴有 M1 型巨噬细胞的浸润[15]。Kwon 等[16]将 THP-1 巨噬细胞来源的条件培养基作用于退变髓核细胞，发现炎症因子白介素-6 (interleukin-6，IL-6)、IL-8、血管内皮生长因子、血管细胞黏附分子、基质金属蛋白酶 1 (matrix metalloproteinase 1，MMP1)、MMP3 表达水平均升高。受脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS) 刺激的 M1 型巨噬细胞浸润退变髓核组织，分泌多种细胞因子 IL-1β、IL-6、IL-12 和 MMP13，加重在肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α) 刺激下退变髓核组织中的炎症反应，进一步破坏细胞外基质合成分解代谢平衡[17]。Hou 等[18]发现 M1 型巨噬细胞可以正调控 LPS 诱导的退变髓核细胞相关功能改变，上调炎症因子 TNF-α、IL-6 和 IL-10 的表达，促使细胞外基质 Ⅱ 型胶原蛋白和蛋白聚糖合成减少，加重氧化应激损伤，调控髓核细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl2 和 Caspase3 的表达，推动 IVDD 进程。Li 等[19]使用骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过转运长非编码RNA-CAHM 至巨噬细胞，抑制 M1 型巨噬细胞的极化，减少髓核细胞的凋亡，缓解细胞外基质的降解。相较于 M1型巨噬细胞，M2 型巨噬细胞具有组织修复及抗炎的功能效应，可以抑制 TNF-α 引起的髓核细胞炎症反应，促进细胞增殖，延缓细胞的凋亡和衰老进程，并且通过增强细胞外基质蛋白多糖和 Ⅱ 型胶原的表达水平，对基质合成过程起到促进作用，维持高浓度 TNF-α 作用下髓核细胞的功能和活性[20]。研究发现，退变椎间盘组织中 DNA 甲基转移酶 1 (DNA methyltransferase 1，DNMT1) 表达升高，而沉默信息调节因子 6 (silent information regulator 6，SIRT6)表达降低，并且 DNMT1 可以负调控 SIRT6 表达。该实验通过抑制 DNMT1 或过表达 SIRT6，抑制 M1 型巨噬细胞极化，促进 M2 型巨噬细胞极化，从而抑制髓核细胞凋亡和焦亡，增强髓核细胞增殖活性[21]。

三、巨噬细胞和髓核细胞相互通讯的主要分子机制

巨噬细胞的极化过程受多种信号通路的调控，在各种信号分子的参与下诱导炎症反应并作用于髓核细胞，其中丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK) 和核转录因子-κB (nuclear transcription factor kappa-B，NF-κB) 通路是参与该过程的主要信号转导途径[22-23]。同时也存在相关信号通路调控髓核细胞增殖凋亡、炎症反应、细胞外基质代谢等生物学过程，如 MAPK、NF-κB、Notch、JAK 激酶 2 (janus kinase 2，JAK2)/ 信号转导和转录激活因子 3 (signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，P13K)/ 蛋白激酶 B (protein kinase B，PKB/ AKT) 等信号通路[24]。

1.MAPK 信号通路介导的分子机制：MAPK 通路包含了四条信号转导途径：细胞外调节激酶 1/ 2 (extracellular regulated protein kinase，ERK1/ 2)、ERK5、c-Jun 氨基末端激酶 (C-Jun N-terminal kinase，JNK) 和 p38/ MAPK[25]。在受到胞外配体刺激后，激活相应上游蛋白激酶磷酸化，通过不同的信号转导途径调控细胞的增殖、分化和凋亡等过程，影响细胞的多种功能活动[26]。

在研究巨噬细胞通过 MAPK 通路调控 IVDD 的作用机制时，发现 MAPK 通路中的不同信号通路具有效果差异性 (图 1)。Park 等[14]将巨噬细胞样 TPH-1 细胞与髓核细胞共培养，分别通过 p38、ERK1/ 2 和 JNK 通路抑制剂进行干扰，发现 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的表达水平均降低，提示这三条信号通路均参与调控巨噬细胞与髓核细胞之间促炎细胞因子表达的过程。Ni 等[27]将M1 型巨噬细胞条件培养基与大鼠髓核细胞 (rat nucleus pulposus cells，rNPCs) 共培养探究两种细胞间相互通讯的分子机制，发现抑制 ERK 信号通路时，rNPCs 中分解代谢基因血小板反应蛋白解整合素金属肽酶 4 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin，Adamts4)、Adamts5、MMP3、MMP13 表达显著降低，Col2a1 表达增强，但 Sox9 和炎症相关基因 IL-6、IL-1β、趋化因子配体 2(C-C motif chemokine ligand，Ccl2)、Ccl3 表达水平无明显变化；抑制 JNK 信号通路，明显降低分解代谢和炎症相关基因表达，合成代谢的被抑制状态没有明显缓解；在 M1型巨噬细胞的调控下，p38 活性无明显变化。表明 ERK 和JNK 通路参与 M1 型巨噬细胞诱导 rNPCs 分解代谢过程。Yang 等[28]研究发现，p38 有 4 种不同亚型 (p38α、p38β、p38γ 和 p38δ)，各亚型在髓核组织中具有不同的分子生物学效应，但在 IVDD 中主要是 p38α、p38β 和 p38δ 发挥作用。p38α 和 p38β 参与 IL-1β 介导破坏细胞外基质代谢平衡的过程，从而导致 IVDD 的进一步加重；而 p38δ 则与p38α 相互拮抗，使椎间盘组织受到相对的保护作用。同时，随着 IVDD 程度增加，退变的髓核细胞可以通过激活p38 MAPK 通路释放促炎细胞因子粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF) 和干扰素-γ (interferon-γ，IFN-γ) 刺激巨噬细胞向 M1 型极化，进一步引起炎症反应[28]。

壳多糖酶 3 样蛋白 1 (chitinase-3-like protein 1，CHI3L1) 是一类与促炎反应相关的分泌糖蛋白[29]。Li等[30]研究发现 M2 型巨噬细胞的其中一种亚型对椎间盘细胞的生存环境可能产生负向影响，由 M2a 型巨噬细胞分泌的 CHI3L1 与髓核细胞表面的白介素-13 受体 α2(interleukin 13 receptor alpha 2，IL-13Rα2) 结合后，在 ERK和 JNK 信号通路介导下，抑制细胞外基质相关分子合成，促使基质降解，破坏微环境中合成与分解代谢的平衡。目前对于 M2 型巨噬细胞的不同亚型在 IVDD 中的研究尚少，暂无充分的证据可以阐明其相互作用的分子机制。

2.NF-κB 信号通路介导的分子机制：NF-κB 是一类以二聚体形式存在的转录因子，也是 Rel 蛋白家族成员之一，受机械应力及多种炎症因子的影响，参与调节 IVDD细胞凋亡和细胞外基质代谢过程，在椎间盘的生理活动中起着重要作用 (图 1)[31]。

趋化因子是一类小分子蛋白，具有募集和激活特定免疫炎症细胞的功能，参与细胞迁移过程，通过刺激不同类型细胞产生相应的细胞因子和基质金属蛋白酶引起炎症反应[32-33]。有研究发现，IL-1、TNF-α 与髓核细胞表面受体结合后，通过 MAPK、NF-κB 通路和 CAAT 区/ 增强子结合蛋白 β (CCAAT/ enhancer binding protein β，C/ EBP-β)上调趋化因子 CCL3 表达水平，使 CCL3 与趋化因子受体1 (C-C chemokine receptor 1，CCR1) 结合诱导巨噬细胞迁移[34]。Li 等[35]研究发现，抵抗素与髓核细胞的 Toll 样受体 4 (toll-like receptors 4，TLR4) 结合后激活 p38 MAPK和 NF-κB 信号通路增强 CCL4 表达，调控细胞间的趋化作用。CCL4 与其受体 CCR1 结合进一步诱导巨噬细胞向椎间盘组织的迁移，引起炎症反应，加重 IVDD 程度[35]。IL-1β 可以通过 NF-κB 信号通路参与髓核细胞凋亡和细胞外基质降解过程[36]。Qian 等[37]对富血小板血浆 (ateletrich plasma，PRP) 外泌体调控髓核细胞凋亡的作用机制进行研究，发现在 LPS 作用下，PRP 外泌体一方面通过降低巨噬细胞内 TNF 受体相关因子 6 (TNF receptor associated factor 6，TRAF6) 蛋白的表达水平，抑制 MAPK 和NF-κB 通路，阻碍其向 M1 型极化，并调控 STAT6 的磷酸化介导 M2 型极化；另一方面减少巨噬细胞内 NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 (NLR pyrin domain-containing 3，NLRP3) 和 IL-1β 前体的产生，抑制巨噬细胞分泌IL-1β，调控髓核细胞内凋亡相关基因 Bax、Bcl2、Caspase3 的表达，延缓髓核细胞凋亡、衰老进程。有研究发现，木兰花碱 (magnoflorine) 可以下调髓样分化因子 88(myeloid differentiation primary response gene 88，Myd88) 蛋白表达、抑制 NF-κB 通路，减少 M1 型巨噬细胞内 NLRP3炎性小体和 IL-1β 的分泌，缓解髓核组织中的炎症反应，减轻髓核细胞损伤程度[38]。同时抑制受损的髓核细胞调控高肌动蛋白家族 B1 (high mobility group box protein1，HMGB1) 的表达，阻碍 Myd88/ NF-κB 通路介导的 M1 型巨噬细胞极化，在一定程度上减轻巨噬细胞与退变髓核细胞之间产生的炎症反应，保护髓核细胞生理功能。

图1 巨噬细胞与髓核细胞相互通讯的分子机制。IκBα (inhibitor of NF-κB)，核因子 κB 抑制因子 αFig.1 The molecular mechanisms of intercellular communication between macrophages and nucleus pulposus cells.IκBα,inhibitor of NF-κB

3.其它信号通路介导的分子机制：有研究发现，在 M1 型巨噬细胞促炎过程中，热休克蛋白 (heat shock protei，HSP) 90 抑制剂 17-烯丙基胺-17-去甲氧基格尔德霉素 (17-allyl-amino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG)通过促进 HSP70 蛋白的表达和抑制髓核细胞内 JAK2/STAT3 信号通路，发挥抗炎和缓解分解代谢的作用，改善巨噬细胞与髓核细胞间相互作用时椎间盘组织微环境(图 1)[39]。另外，17-AAG 也对介导 M1 型巨噬细胞促炎反应的 MAPK 和 NF-κB 通路具有一定的抑制作用。Takayama等[40]研究发现，凝血酶与蛋白酶激活受体 1 (proteaseactivated receptor 1，PAR1) 结合后，通过激活 MAPK/ERK 和 PI3K/ AKT 信号通路调控髓核细胞产生单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1，Mcp-1)和 MMP3，Mcp-1 刺激并诱导巨噬细胞的浸润。加入抗Mcp-1 中和抗体和 PAR1 抑制剂后明显改善巨噬细胞浸润现象。表明凝血酶与 PAR1 参与调节小鼠椎间盘细胞功能过程，并与巨噬细胞迁移存在一定的相关性。巨噬细胞分泌的各种促炎细胞因子可以破坏髓核细胞的基质代谢平衡，促进基质代谢相关基因 MMP3、MMP13、Adamts4 等表达升高，尤其是 MMP13。在髓核细胞中过表达 Notch1受体胞内结合域 (notch1 intracellular domain，NICD1)，激活 Notch 信号通路，抑制由巨噬细胞分泌的促炎细胞因子介导的髓核细胞分解代谢基因高表达[41]。Gao 等[42]发现髓核细胞分泌的 CX3C 趋化因子配体 1 (CX3C chemokine ligand 1，CX3CL1) 可以诱导单核细胞迁移浸润至椎间盘组织，并与 CX3C 趋化因子受体 1 (CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1) 通过 JAK2/ STAT3 信号通路诱导单核细胞向 M2 型巨噬细胞极化，促使 M2 型巨噬细胞可以分泌 CCL17 抑制髓核细胞的凋亡。此外，Wu 等[43]发现髓核细胞通过 CX3CL1/ CX3CR1 轴不仅可以诱导巨噬细胞M2 极化，还可以促使 M2 巨噬细胞增强髓核细胞增殖和活力，抑制细胞外基质降解，缓解髓核细胞炎症反应。

四、讨论与总结

炎症反应在 IVDD 发生发展过程中起着重要的作用，在炎症因子和趋化因子的刺激下，巨噬细胞被激活并募集到髓核组织区域，引起细胞浸润并分泌促炎细胞因子作用于髓核细胞，形成炎性微环境，影响髓核细胞的生物学功能，出现细胞增殖抑制、细胞凋亡、基质代谢失衡等异常表现[44-46]。受炎症刺激的髓核细胞反作用于巨噬细胞，椎间盘组织的退变程度随着微环境中的炎症反应增加而加剧，退变的椎间盘组织不仅调节巨噬细胞向炎性表型极化，还诱导巨噬细胞进一步浸润髓核组织，加快 IVDD 的进程[23,47]。

如图 1 所示，巨噬细胞与髓核细胞之间主要通过TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-8 等促炎细胞因子，MMPs 和ADAMTs 等基质金属蛋白酶以及 CCL3、CCL4 和 MCP-1 等趋化因子调控这两种细胞的生物学功能。多个信号通路参与调控 IVDD 的发生与进展，其中 MAPK 和 NF-κB 通路是参与巨噬细胞和髓核细胞之间相互通讯的主要信号转导途径，此外，还包括 JAK2/ STAT3、PI3K/ AKT、Notch 等信号通路[23,39-41,45]。通过对相关通路的深入研究进一步明确了不同细胞因子和生物活性蛋白在两种细胞间相互通讯中的分子机制。不同信号通路形成交叉网络，彼此相互影响、相互作用，胞外信号分子和胞内相关分子共同构成了巨噬细胞和髓核细胞之间的通信系统。

此外，IVDD 是多种因素相互作用并参与调节的复杂过程，研究表明 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、神经生长因子、生物力学载荷等因素调节椎间盘免疫炎症反应、神经性疼痛等过程[48-50]，相关作用机制有待于进一步深入探讨。

综上所述，巨噬细胞与髓核细胞间通讯机制在 IVDD发生发展中起着重要的作用。在炎性环境下巨噬细胞与髓核细胞通过不同的信号通路调节炎症因子、趋化因子和基质金属蛋白酶等分子的表达，改变凋亡相关蛋白的表达水平和细胞外微环境状态。巨噬细胞在各种因素的刺激下，对处于炎性环境中的髓核细胞造成慢性进展性的损伤，破坏细胞生存环境的稳态，引起细胞外基质成分降解，降低髓核组织抵抗外界机械负荷的能力。同时，受损退变的髓核细胞对巨噬细胞引起的异常变化产生相应的反馈作用，分泌相关细胞因子促使巨噬细胞极化并诱导巨噬细胞迁移浸润，两者之间形成炎性相互作用，进一步调控 IVDD 的发展进程。目前巨噬细胞与髓核细胞之间通讯机制存在复杂性及不确定性，深入研究其相互通讯的分子机制，对于阐明 IVDD 发生发展过程，探索临床预防和诊疗 IVDD 的潜在干预靶点有着重要的意义。