CTLA-4纳米抗体与肿瘤适配体共修饰的双靶向脂质体构建*

万瑞融 王希斌

广西医科大学第一附属医院药学部,广西南宁市 530021

免疫疗法是恶性肿瘤继手术、放疗和化疗之外的第四种治疗新方法,其中把T淋巴细胞作为肿瘤杀伤的效应细胞称之为过继疗法,是肿瘤免疫治疗的良好策略之一[1]。但是传统的T细胞过继治疗肝癌方法,难以获得满意的募集效应细胞至肿瘤部位效应,同时缺乏靶向识别肿瘤细胞和正常细胞的能力,因此需要寻找新的策略来提高T细胞过继治疗的效果。

双特异性抗体(Bispecific antibody,BsAb)是指能够同时靶向两个抗原或者一个抗原的两个不同表位的基因工程抗体。由于其特异性和双功能性,现已在肿瘤治疗及自身免疫病等领域中引起广泛关注[2]。适配体是一类分子量小、易于修饰合成、低毒低免疫原性、组织渗透性强等优点的靶向识别分子,也已在生物医药领域开展了广泛研究[3]。本项目设想通过CTLA-4纳米抗体阻断T细胞活化过程中的负性共刺激分子而进一步诱导T细胞的杀伤肿瘤效应,同时联合适配体的肿瘤细胞靶向识别能力,构建一种新型的BsAb,希望其能将更高效能的T细胞靶向募集至肿瘤部位,从而发挥肿瘤的特异性杀伤作用。因此,本研究利用前期工作已经筛选出的CTLA-4特异性纳米抗体Nb16[4],结合能特异性结合肝癌细胞HepG2的TLS11a适配体,制备一种新型的BsAb,有望为肿瘤的免疫治疗提供一条有潜在临床应用价值的新策略。

1 材料与方法

1.1 主要材料 1-棕榈酰基-2-硬脂酰基(POPC)、双十八烷基溴化铵(DDAB)、胆固醇(Chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺—聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)、磷脂聚乙二醇马来酰亚胺[DSPE-PEG(2000)-MAL],购自美国Avanti polar lipids公司。修饰巯基的适配体由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其序列为:5’-ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTC-ATGGACGTGCTGTTTTTTTTTT-SH-3’。

1.2 实验仪器 高速离心机(Thermo,德国),冷冻干燥机(Martin Christ,德国),小型喷雾干燥器,Nano-S 型激光粒度分析仪(Malvern,英国),透射电子显微镜(日立,日本),流式细胞仪(Beckman,美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 双靶向脂质体的制备。(1)采用薄层水化法制备空载脂质体(Lipo):将POPC、Chol、DSPE-PEG2000、DDAB和DSPE-PEG(2000)-MAL按质量摩尔比52∶40∶5∶3∶0.3比例溶解到圆底烧瓶的氯仿溶液中,然后使用旋转蒸发仪(设定温度为60℃)旋转蒸发10min便可得到脂质薄膜状固体。连同圆底烧瓶将所得脂质薄膜放置于真空干燥仪中干燥过夜,除去残留有机溶剂。然后将瓶底的脂质薄膜用1ml 300mmol/L的枸橼酸缓冲液 (pH=4.0) 进行水化,随后置于50℃的水浴中超声20min,再使用液氮和60℃水浴循环冻融5次。将所得产物装入脂质体挤推器,依次通过200nm、100nm的聚碳酸酯膜各20次,最后便可得到直径约100nm的空白脂质体。(2)制备适配体和纳米抗体共修饰的双靶向脂质体:纳米抗体、适配体、脂质体按照质量摩尔比1∶1∶10的比例混合到PBS溶液中,混匀,然后4℃条件下震荡孵育 24h,最后使用HEPES透析后即可获得Nb16-Lipo-TLS11a。(3)制备荧光脂质体:在全程避光条件下,将纳米抗体、适配体、脂质体、FITC荧光染料按质量摩尔比1∶1∶10∶1混合到PBS溶液中,然后按照制备Nb16-Lipo-TLS11a一样的步骤进行,便可得到带荧光的F-Nb16-Lipo-TLS11a。(4)为了验证双靶向脂质体的体外靶向性能,我们还制备了单一修饰的荧光脂质体,包括只修饰适配体脂质体(Lipo-TLS11a)和只修饰纳米抗体的脂质体(Nb16-Lipo),即在上述空白脂质体中分别只加入适配体或纳米抗体溶液混匀,余步骤同前。

1.3.2 双靶向脂质体的表征。使用Zetasizer粒度电位仪测量和分析脂质体的粒径和电位;通过透射电子显微镜观察并拍摄脂质体的形态特点。

1.3.3 双靶向脂质体体外靶向活性检测。流式细胞仪实验。采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从健康供体的全血中分离出人外周血单核细胞(PBMCs)(已提供知情同意书)。将PBMCs悬浮于含10% FBS的RPMI-1640培养基中1h。去除未贴壁细胞,然后用尼龙羊毛纤维分离T细胞。所有流式细胞实验均在4℃下进行。使用植物血凝素PHA( 10μg/ml)刺激T细胞,然后将3×105刺激的T细胞在30min内用PBS/2% BSA溶液振荡饱和,以避免非特异性结合。在PBS/2% BSA中加入荧光双靶向脂质体F-Nb16-Lipo-TLS11a(设置另外一组加入只修饰适配体的脂质体Lipo-TLS11),孵育30min。PBS洗涤3次后,流式细胞仪检测结合情况。

检测双靶向脂质体与肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞HL-7702的结合:取对数生长期的HepG2细胞,同时设置不能与适配体TLS11a结合的HL-7702细胞作为对照,分别取3×105细胞于50μl PBS溶液中重悬,然后加入40μl PBS溶液、10μl胎牛血清和荧光双靶向脂质体F-Nb16-Lipo-TLS11a混匀(设置另外一组加入只修饰纳米抗体的脂质体Nb16-Lipo),混匀,于4℃、避光条件下孵育30min,最后使用PBS 洗涤细胞并离心5min,重复洗涤3次,最后重悬细胞进行流式细胞术检测。以上流式细胞术所获得数据均采用Flow Jo软件进行分析。

2 结果

2.1 双靶向脂质体的表征 通过TEM观察可以看到(见图1a),双靶向脂质体Nb16-Lipo-TLS11a具有圆球形或椭圆球形形态,大小均质,而且分散性良好。空载脂质体Lipo的平均水化粒径是94.57nm,在逐步修饰纳米抗体和适配体后,平均粒径分别增大至99.67nm与103.43nm(见图1b)。电位检测显示(见图1c),无修饰的空载脂质体的平均电位为18.76mV,由于适配体核酸序列和纳米抗体蛋白表面为负电荷,因此在修饰双靶向分子后,靶向脂质体电位发生了负向偏移。经过检测,双靶向脂质体表面平均电位为9.14mV,这说明适配体修饰成功。

图1 双靶向脂质体的表征

2.2 流式细胞仪分析双靶向脂质体的体外靶向能力 为了分析双靶向脂质体Nb16-Lipo-TLS11a结合PHA刺激的人T细胞的能力,进行了流式细胞术试验。结果表明,只修饰适配体的脂质体Lipo-TLS11a不能结合活化的T细胞,而双靶向脂质体Nb16-Lipo-TLS11a能识别活化的T细胞 (见图2a),说明双靶向脂质体修饰纳米抗体后拥有了靶向结合T细胞上的CTLA-4位点的能力。同时,双靶向脂质体Nb16-Lipo-TLS11a也能识别表达肝癌HepG2细胞 (见图2b),却无法靶向结合HL-7702细胞(见图2c),说明双靶向脂质体通过修饰适配体后,具备了特异性识别肿瘤细胞的能力。

图2 流式细胞仪检测双靶向脂质体的体外靶向能力

3 讨论

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4 (Cytotoxic Tlymphocyte-associated Antigen-4,CTLA-4) 受体是第一个用作临床靶标的免疫检查点[5],也是T 细胞表面最具代表性的免疫抑制点分子。目前,人们利用CTLA-4抗体阻断T细胞活化过程中CTLA-4对T细胞活化后的抑制,从而促进机体的抗肿瘤免疫应答,使获得满意的抗肿瘤效应成为可能。然而传统抗体在实际应用中仍存在问题亟待解决,如抗体分子量大,在瘤内的穿透性欠佳等,因此有必要建立更加高效、穿透力强的新型抗体用于肿瘤治疗。抗体人源化、高效化及小型化均已成为当前抗体药物研究的主要趋势[6]。纳米抗体(Nanobody,Nb)是目前可以得到的稳定的可结合抗原的最小单位[7]。纳米抗体是一种小型的基因工程抗体,由于它具备良好稳定性、强组织穿透力及较弱的免疫原性,使其在肿瘤免疫治疗等方面展现巨大的应用潜力[8]。本课题组前期已筛选出了CTLA-4特异性的纳米抗体Nb16,实验证明其与CTLA-4抗原有较好的结合力与活性[4],具有巨大的应用潜力。

阻断CTLA-4对T细胞活化后的抑制还不够,如何将肿瘤杀伤效应T细胞富集至肿瘤部位也是目前研究的热点方向。适配体能够通过三维结构以高亲和力特异性结合在靶标上,能够为主动靶向肿瘤细胞提供理想的靶向分子,被广泛应用于药物靶向治疗及肿瘤检测等领域[9-10]。因此,本研究首次将纳米抗体和适配体联合,结合纳米技术,以脂质体为连接介质,将这两种具有不同靶向效能的小分子连接,从而构建一种具有BsAb功能的双靶向脂质体Nb16-Lipo-TLS11a。本实验结果初步证明了Nb16-Lipo-TLS11a构建成功,并且其具有同时靶向结合PHA活化的T细胞和肿瘤细胞HepG2的能力。但是,Nb16-Lipo-TLS11a是否能将活化T细胞定向募集至肿瘤细胞,实现对肿瘤的高效且特异性杀伤,还有待本课题组在后续实验中进一步验证。

总之,本研究制备了一种CTLA-4纳米抗体与肿瘤适配体共修饰的双靶向脂质体Nb16-Lipo-TLS11a。理论上,这种脂质体能通过Nb16阻断T淋巴细胞活化过程中的负性共刺激分子而进一步诱导T细胞的杀伤肿瘤效应,同时基于适配体对肿瘤细胞的靶向识别能力,可以将肿瘤杀伤T淋巴细胞靶向募集至肿瘤部位进行特异性杀伤。而且,通过替换靶向不同靶标的适配体,可以实现对各种肿瘤的靶向治疗,为肿瘤的免疫治疗提供了新思路。