负载 ZIF-8 的GelMA 水凝胶制备及其药物缓释性能和抑菌作用评价

姜孔昭, 李驰宇, 罗云纲, 刘志辉

（1. 吉林大学口腔医院修复科， 吉林 长春 130021； 2. 吉林大学第二医院骨科，吉林 长春 130022；3. 吉林大学第一医院净月分院口腔科，吉林 长春 130117)

皮肤是人体最大的器官，具有保护体内器官不受外界因素影响和抵御微生物感染等功能［1-2］。皮肤受损后，持续的细菌感染会导致长期的慢性炎症， 减缓伤口愈合进程，使其转变为慢性伤口［3-4］。伤口敷料可在一定程度上避免受损部位与外界接触，降低细菌感染风险，有助于伤口愈合。但传统的伤口敷料，如纱布和绷带，仅具有止血、吸收渗出液和物理屏障等简单功能，并且由于材料的固有缺陷而易黏附于肉芽组织上。水凝胶因其仿生结构和特有的理化性能有望成为新型伤口敷料［5-7］。水凝胶具有三维多孔结构，能够吸收伤口渗出液、 保持伤口湿润和促进气体交换，并对细菌和灰尘具有屏障作用。此外，许多治疗性药物能够加载至水凝胶中，如抗生素、生长因子和中药等活性物质［8-9］。考虑到伤口多为不规则形状，理想的水凝胶敷料应能够原位注射覆盖伤口，并及时凝胶化以起到屏障作用。甲基丙烯酸酐化明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）是一种由甲基丙烯酸酐（methacrylic anhydride，MA）修饰的明胶衍生材料，因为其含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列和对基质金属蛋白酶敏感的基序，其性质类似于天然细胞外基质［10-11］。 最近的研究［12-14］表明：GelMA 允许细胞黏附和重塑，是组织再生的支架材料。GelMA 在体温下为液体，在波长 405 nm 光作用下可以交联。由于良好的生物相容性和独特的物理化学性质［15］，GelMA 可应用于伤口愈合研究领域，GelMA 基水凝胶可作为伤口敷料使用。但GelMA 无抗菌功能，难以满足应用于感染伤口的要求，因此需要添加抗菌物质赋予其特定功能。抗生素的过度使用会引起细菌的耐药性，给人类健康造成巨大威胁，增加了治疗负担［16］。沸石咪唑类骨架材料8（zeolite imidazole framework-8，ZIF-8）是一种非抗生素类抗菌化合物，因其制备工艺简单且抗菌效果和生物相容性良好，可作为抗生素的替代品。由ZIF-8 中释放的 Zn2+可以破坏细菌被膜的完整性，催化氧自由基产生，从而导致细菌死亡［17］。此外，ZIF-8 纳米颗粒的粗糙表面可以增加其与细菌的接触面积，更好地发挥抗菌活性。XIA 等［18］证实：ZIF-8@Rutin 复合物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有杀菌活性，并可用于伤口愈合。DENG 等［19］证实：负载ZIF-8 的纤维素水凝胶具有同样良好的杀菌活性及促进皮肤再生的成血管活性。将ZIF-8 与GelMA 结合，既可发挥水凝胶用于伤口敷料的优势，也具备一定的抗感染能力。本研究采用水热法合成 ZIF-8 颗粒，并与GelMA 混合制备复合水凝胶 GelMA-ZIF-8（GelMA-Z），通过观察 GelMA-Z 水凝胶对 NIH-3T3 细胞、大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）的影响，探讨 GelMA-Z 的生物相容性和抗菌性能，为感染性伤口的治疗提供新材料。

1 材料与方法

1.1 细菌、细胞、主要试剂和仪器

E.coli、S.aureus和小鼠胚胎成纤维NIH-3T3细胞由吉林大学第二医院提供。GelMA 和苯 基（2，4，6-三甲基苯甲酰基） 磷酸锂盐（lithium phenyl-2，4，6-trimethylbenzoylphosphinate，LAP）（中国 EFL 公司），六水合硝酸锌和2-甲基咪唑（上海阿拉丁生化科技有限公司），DMEM F12 高糖培养基和青-链霉素溶液（美国Hyclone 公司），胎牛血清（美国 BI 公司），CCK-8 试剂盒（美国Invitrogen 公司），LB 肉汤和LB 营养琼脂培养基（中国海博生物公司），活/死细菌染色试剂盒（上海贝博生物科技有限公司）。恒温细胞培养箱（型号：SLI- 1200，日本 Sanyo 公司），多功能酶标仪（型号：BL340，美国 BioTech 公司），扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）（型号：SSX-550，日本岛津公司），原子吸收分光光度计（型号：TAS-990，北京普析通用仪器有限责任公司）， 倒置荧光显微镜（型号： Ⅸ73， 日本Olympus 公司）。

1.2 ZIF-8 颗粒的制备和表征

水热法合成ZIF-8 颗粒［20］。首先，于80 mL 去离子水中溶解 2- 甲基咪唑 4.54 g 和六水合硝酸锌0.22 g，轻轻搅拌 20 min。将该混合物置于聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，37 ℃加热 6 h，离心得到 ZIF-8 颗粒，甲醇清洗 3 次，37 ℃烘干，收集备用。将 ZIF-8 颗粒粘于金属台的导电双面胶上，采用 SEM 观察 ZIF-8 颗粒微观形态表现。

1.3 GelMA-Z 的制备

将GelMA（10% W/V） 和 LAP（0.2%） 溶于去离子水中，50 ℃水浴搅拌3min，制备GelMA溶液。使用0.22 μm 微孔的无菌滤膜过滤，最终获得无菌GelMA 溶液。将无菌ZIF-8 颗粒均匀分散于GelMA 溶液中，40 ℃避光搅拌过夜，得到含ZIF-8浓度为0.2%（W/V）的GelMA-Z复合水凝胶。

1.4 原子吸收光谱（atomic absorption spectroscopy，AAS）法检测GelMA-Z 的Zn2+释放量

将 300 μL GelMA-Z 预凝胶溶液注射至圆柱形模具中，光照射交联 15 s。将交联后的水凝胶浸于3 mL PBS 缓冲液（pH 7.4） 中，密封置于37 ℃恒温环境。在 12 h、1 d、3 d 和7 d 时，每组取出1 mL 溶液并加入等体积 PBS 缓冲液。采用AAS法检测各时间点样本溶液中Zn2+浓度，并计算出各时间点累计总Zn2+浓度。累计释放量计算公式：C累计=Cn×V+Vm×∑i-1n-1Ci，其中C累计为 Zn2+累积释放量（mg·L-1），Cn为第n 次取样时溶液中Zn2+的质量浓度（mg·L-1），Ci为第i 次取样时溶液中 Zn2+的质量浓度（mg·L-1），V 为释放介质的总体积（mL），Vm为每隔一段时间内取出的释放溶液体积（mL）。

1.5 CCK-8 法检测各组细胞存活率

NIH-3T3 细胞分为对照组、 GelMA 组和GelMA-Z 组，将 GelMA 和 GelMA-Z 预凝胶溶液（50 μL）注射至24 孔细胞培养板中，光照射 15 s，然后将NIH-3T3 细胞以每孔5×103的密度接种于孔板中，与水凝胶共培养。加入 1 mL 含10%胎牛血清和 1%青-链霉素的 DMEM F12 高糖培养基，于5% CO2、37 ℃条件下培养。培养基每2 d 更换1 次。 在第1、 3 和7 天时， 每孔更换含有10%CCK-8 溶液的培养基。37 ℃孵育2 h，采用酶标仪检测各组细胞上清液于波长600 nm 处吸光度（A）值，并计算各组细胞存活率。细胞存活率=（实验组A 值-空白组A值）/（对照组A 值-空白组A 值）×100%。

1.6 检测GelMA-Z 的抗菌性能

1.6.1 细菌的复苏和培养 将冻存的E.coli和S.aureus菌液取出，采用无菌接种环蘸取菌液涂布于 LB 营养琼脂板上。37 ℃条件下培养 3 d。使用无菌接种环从LB 营养琼脂板上取2～3 个菌落分散于 5 mL 液体培养基中，37 ℃培养 2 d。采用液体培养基将菌液密度调整至1×106CFU·mL-1用于后续实验。

1.6.2 绘制细菌生长曲线 实验分为对照组、GelMA 组和GelMA-Z 组。将 300 μL GelMA 和GelMA-Z 预凝胶溶液注射圆柱形模具中，光交联15 s。将交联后的 GelMA 和GelMA-Z 分别放入3 mL 菌液中，对照组只含有3 mL 菌液，于37 ℃条件下培养。0、12 和24 h 检测各组细菌在波长600 nm 处的A 值，代表细菌活性。

1.6.3 平板抑菌实验 实验分为对照组、GelMA组和GelMA-Z 组，将 300 μL GelMA 和 GelMA-Z预凝胶溶液注射至圆柱形模具中，光交联 15 s 后分别放入3 mL 菌液中，对照组只含有3 mL 菌液，37 ℃ 条件下培养。将每组菌液梯度稀释至1×105CFU·mL-1后，取100 μ L 菌液均匀涂布于LB 营养琼脂板上。菌液充分吸收后倒置，37 ℃培养2 d，拍照记录菌落形成情况。

1.6.4 活/死细菌染色实验 实验分为对照组、GelMA 组和GelMA-Z 组。将300 μL GelMA 和GelMA-Z 预凝胶溶液注射至圆柱形模具中，光交联15 s 后分别放入3 mL 菌液中，对照组只含有3 mL 菌液，37 ℃培养 6 h 离心收集各组细菌，0.85% NaCl 溶液冲洗细菌3 次，采用适量的活/死细菌染色工作液重悬细菌，室温避光孵育 15 min。0.85% NaCl 溶液冲洗细菌1 次，适量的 0.85%NaCl 溶液重悬细菌，荧光显微镜观察活/死细菌染色情况。

1.7 统计学分析

采用 SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，所有实验至少重复 3 次。各组细胞存活率和各组细菌活性均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ZIF-8 颗粒的表征

SEM 观察显示：ZIF-8 颗粒呈圆形，粒径均匀，平均粒径（0.41±0.09）μm 。见图1。

图1 ZIF-8 的微观形态表现(SEM,Bar=5 μm)Fig. 1 Microscopic morphology of ZIF-8 (SEM,Bar=5 μm)

2.2 GelMA-Z 水凝胶的 Zn2+释放量

GelMA-Z 在 1 d 内有一段突释，该部分Zn2+可能主要来源于水凝胶表面的ZIF-8 颗粒。1 d 后Zn2+的释放速率逐渐减慢，其稳定释放一直持续至7 d，表明GelMA 可能具有保护作用，可降低ZIF-8 颗粒的水解速度。见表1。

表1 不同时间点GelMA-Z 的Zn2+累计释放量Tab. 1 Cumulative release amounts of Zn2+ at different time points [n=3，，ρB/（mg·L-1)]

表1 不同时间点GelMA-Z 的Zn2+累计释放量Tab. 1 Cumulative release amounts of Zn2+ at different time points [n=3，，ρB/（mg·L-1)]

?

2.3 各组细胞存活率

将 NIH-3T3 细胞与水凝胶共培养1、 3 和 7 d后，对照组、GelMA 组和 GelMA-Z 组在相同时间点细胞存活率均大于 90%，并且组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明 GelMA 和GelMA-Z具有良好的细胞相容性，不影响 NIH-3T3 细胞增殖。见表2。

表2 各组细胞存活率Tab. 2 Survival rates of cells in various groups(n=3， ， η/%）

表2 各组细胞存活率Tab. 2 Survival rates of cells in various groups(n=3， ， η/%）

?

2.4 各组细菌活性

在体外抗菌实验中， 对照组和GelMA 组E.coli和S.aureus在 24 h 内持续增殖，与对照组和GelMA组比较，6、12和24 h时GelMA-Z 组2 种细菌活性明显降低（P＜0.05）。见表3 和4。

表3 不同时间点各组E. coli 的活性Tab. 3 Activities of E. coli in various groups at different time points(n=3，）

表3 不同时间点各组E. coli 的活性Tab. 3 Activities of E. coli in various groups at different time points(n=3，）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with GelMA group.

?

表4 不同时间点各组S. aureus 的活性Tab. 4 Activities of S. aureus in various groups at different time points(n=3，）

表4 不同时间点各组S. aureus 的活性Tab. 4 Activities of S. aureus in various groups at different time points(n=3，）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with GelMA group.

?

与对照组和GelMA 组比较，GelMA-Z 组2 种细菌菌落数量明显减少。见图2。活/死细菌染色结果显示：GelMA-Z 组大部分细菌死亡（红色荧光染色），而对照组和 GelMA 组多数为活细菌（绿色荧光染色）。见图3。

图2 各组E. coli 和S. aureus 菌落形成情况Fig. 2 Bacterial formation of E. coli and S. aureus in various groups

图3 各组活/死细菌染色情况(Bar=25 μm)Fig. 3 Staining condition of living/dead bacteria in various groups (Bar=25 μm)

3 讨 论

感染伤口的愈合需要抗菌敷料的支持，目前已经设计和研究出具有抗菌性能的水凝胶敷料［21］，其中药物载体和抗菌剂是关注的重点。

理想的载体应具有生物相容性好、稳定性好和可塑性强等特点。GelMA 是一种由明胶和甲基丙烯酰酐共聚合而成的光交联材料，具有以下优点：①生物相容性好。GelMA 由明胶制成，是一种天然的生物高分子材料，在人体内具有良好的生物相容性，不会引起过敏或排异反应。②可调节性强。通过改变甲基丙烯酸酐的接枝率，可以精确地调节GelMA 的物理和化学性质， 以满足不同伤口愈合的需要。③易于操作。未交联的 GelMA 在室温下呈黏稠液态，易于填充不规则伤口，405 nm 波长光照后立即交联固定，使其在治疗伤口时更加方便。④模拟组织特性。由于水凝胶基质为明胶，GelMA 的机械特性和形态与人体软组织非常相似，能够进行更好的组织和细胞工程修复。⑤促进细胞生长。GelMA 中的明胶可以在一定程度上促进细胞生长和增殖，有利于伤口的愈合。因此，GelMA 作为一种新型伤口敷料，已被广泛应用于组织工程和医学等领域，可以促进伤口的愈合，缩短愈合时间，提高治疗效果。

抗菌剂应具有良好的抗菌性能，此外其细胞相容性和是否容易产生耐药性均是需要重点考虑的问题。目前常见的抗菌剂有金属离子、抗菌肽、抗生素和季铵盐化合物等多种类型［22-23］。其中金属离子具有广谱杀菌作用、低毒性和不易产生耐药等优点。ZIF-8 是一种由Zn2+和有机配体组成的金属有机框架材料。ZIF-8 作为Zn2+载体，能够稳定释放Zn2+，发挥各种生物学功能。

本研究首次将 ZIF-8 和 GelMA 联合使用，构建抗菌光交联水凝胶。GelMA-Z 主要的抗菌机制是释放 Zn2+。Zn2+是目前医学领域中常用的一种抗菌金属离子，其应用范围广泛，具有较高的安全性和效果。Zn2+主要用于各种感染性疾病的治疗，如口腔感染、皮肤感染、消化道感染和眼部感染等。含Zn2+的漱口水、牙膏和含片等产品可有效预防口腔感染；Zn2+对幽门螺旋杆菌具有明显的抑制作用，因此被广泛应用于胃溃疡和十二指肠溃疡的治疗；含Zn2+抗菌剂应用于眼科领域用于治疗各种眼部感染，如结膜炎和角膜炎等。Zn2+能够与细胞膜上的磷脂双分子层和蛋白质相互作用，引起膜内的酶活性变化和磷脂的氧化损伤，最终导致细胞膜破裂和细胞死亡。研究［24-25］表明：Zn2+主要通过促进膜脂过氧化作用破坏细菌细胞膜的完整性，可以干扰细菌的吸收、代谢和转运等生化过程，从而抑制菌体的生长和增殖；可以在细菌内部产生氧化应激反应，诱导产生大量自由基，导致DNA 和蛋白质等生物大分子的损伤和细菌死亡；干扰细菌的信号传递过程，抑制一些关键酶的活性，从而阻碍细菌的正常生长和代谢。本研究中，GelMA-Z可稳定释放Zn2+，对E.coli和S.aureus具有明显抑制作用。

综上所述，本研究制备了负载ZIF-8 颗粒的GelMA 复合水凝胶GelMA-Z，并进行了注射性、光交联性、体外毒性和抗菌性能检测，结果表明：负载质量分数为0.2% ZIF-8颗粒的光交联GelMA-Z复合水凝胶具有可注射性和良好的生物相容性，并且该水凝胶能够发挥明显的抗菌作用。本研究结果为抗菌敷料的研究提供了新思路。

利益冲突声明：

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

姜孔昭参与实验设计、起草和修改论文，李驰宇参与论文修改，罗云纲参与研究设计和论文指导，刘志辉参与研究数据整理和统计学分析。