雌性斑马鱼暴露于环境剂量三唑磷对亲代生殖和氧化应激及子代胚胎发育的影响

汪和祥 李瑞娇 张建禄 张春云 王立新 陈 绪 梁 昊 熊冬梅

(1.西北农林科技大学动物科技学院水产科学系, 杨凌 712100; 2.陕西省水产研究与技术推广总站, 西安 710086;3.陕西省秦岭生态安全重点实验室, 陕西省动物研究所, 西安 710032)

三唑磷作为一种高效广谱有机磷硫代磷酸酯类农药, 通过抑制乙酰胆碱酯酶活性破坏神经系统功能而达到杀灭害虫的效果, 在农业生产中被广泛用作杀虫杀螨剂, 以提高棉花、水稻、小麦、茶叶、水果和蔬菜等多种作物产量[1—6], 此外, 在渔业上还被用作海水贝类养殖池的清塘剂[7]。据报道2013—2018年, 我国三唑磷年均用量约1万吨[8]。三唑磷的大量使用造成农产品和环境中的高残留, 随着地表径流、污水排放和雨水冲刷等最终汇入江河或海洋[9,10], 且由于其半衰期较长, 进入水体后短时间内难以降解, 如印度运河中三唑磷半衰期约为25d[11]。我国福建省九龙江中有5个采样点的三唑磷浓度在100 ng/L以上, 最高浓度为1055 ng/L[10];东海中三唑磷的残留浓度高达8530.50 ng/L[12]; 温州苍南县某网箱养殖水体中检测到三唑磷含量为0.011 mg/L[13]。

水体中三唑磷残留对水生生物造成负面影响已引起学者们的密切关注。有研究表明三唑磷对水生生物具有较高毒性, 可引起多种水生生物中毒、氧化损伤、组织结构破坏、miRNA表达水平变化甚至死亡[7,13,14—16]。三唑磷还可对鱼类胚胎和仔鱼产生影响, 如诱导稀有鲫(Gobiocypris rarus)胚胎及仔鱼畸形率和死亡率增加, 导致其体长和心率下降[17], 造成草鱼(Ctenopharyngodon idella)胚胎严重畸形和死亡[18]。三唑磷已成为严重威胁水生生态系统安全的污染物之一[14,19]。

三唑磷作为神经毒物, 除了造成生物明显的神经损伤, 还具有环境雌激素效应, 影响受试动物的生殖功能[20]。例如大鼠(Rattus norvegicus)口服三唑磷引起卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡, 可能干扰雌激素/孕激素平衡, 对生育能力有潜在影响[21]; 雌性大鼠孕前口服三唑磷30d后产仔数略有减少, 造成子代皮毛发育显著延迟、体重下降及子代性比显著改变, 三唑磷影响雌性大鼠生殖性能[22]。此外, 三唑磷对褐飞虱(Nilaparvata lugens)和灰飞虱(Laodelphax striatellus)的产卵有显著的刺激作用[23]。以上研究多聚焦于三唑磷的急性毒性试验, 且所用三唑磷剂量远高于环境中的实际浓度, 而环境剂量三唑磷长期暴露对鱼类生殖毒性鲜有报道。

鱼类是水生生态系统中的重要组成部分, 是水生食物链中的高级消费者, 对水域生态环境具有重要的指示作用。斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物之一, 具有体型小、繁殖周期短、雌雄特征明显、体外受精和胚胎透明等优势, 被广泛用作发育生物学和毒理学研究的受试生物[24,25]。

本研究将3月龄雌性斑马鱼暴露于环境浓度三唑磷21d, 探究其对亲代生殖力、子代胚胎发育及亲子代氧化应激的影响, 旨在评估三唑磷对淡水生态系统的风险, 积累三唑磷对鱼类的亚慢性毒理试验数据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

三唑磷(纯度98.9%, CAS: 24017-47-8)购于成都艾科试剂公司, 三唑磷母液(107μg/L)以二甲基亚砜(DMSO, 99.5%)为助溶剂进行配制, 并于4℃黑暗条件保存, 暴露期间取母液用除氯自来水配制所需浓度。本试验所用试剂均为分析纯等级。

1.2 实验鱼

三月龄野生型斑马鱼购自中国科学院水生生物研究所(湖北武汉)。实验鱼在正式试验开始前于(26±1)℃的循环除氯自来水中驯养适应2周, 光暗周期为14h∶10h(明/暗), 每日投喂商品饲料2次, 日投喂量不超过体重的2%。

1.3 毒性试验与自然繁殖及采样

在驯养结束后随机挑选健康的雌性斑马鱼进行暴露试验, 并记录初始体重。前文提到三唑磷的半衰期约25d且自然水域检测到的残留浓度为8.53 μg/L[11,12], 因而本文选择环境剂量三唑磷(10 μg/L)进行21d亚慢性暴露, 以0.001% (v/v)DMSO作为溶剂对照组。每个处理组设3个重复, 每个重复9尾鱼,每48h更换暴露液总体积的1/2。暴露试验期间保持与驯养期间相同的喂养条件, 暴露结束后称量雌鱼终末体重(n=3), 同时将全部雌鱼与未暴露雄鱼置于清水中按1∶1配对, 次日早晨7:00繁殖产卵, 产卵持续2h后收集受精卵并用清水洗涤两次以备后续试验。受试雌鱼均只进行一次配对产卵。雌鱼在产卵结束2h后立即以间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222, 100 mg/L)进行麻醉, 解剖并取出肝脏, 液氮速冻后存于-80℃用于酶活测定等, 同时取出性腺并称重, 用于计算性腺成熟系数(GSI;n=27), 然后将未产卵雌鱼的性腺固定于波恩氏液。

1.4 胚胎发育观察

收集受精卵, 统计胚胎受精率。在体视镜下(Phenix-XTL-3B)用数码相机(ZXcamera-1600)观察受精卵并测量卵径、初孵仔鱼体长。在胚胎发育48h后, 于光学显微镜(Motic-BA210LED)下测定胚胎心率。仔鱼孵化出膜后24h统计孵化率及畸形率。胚胎受精率为每个重复中未受精胚胎数与总胚胎数的比值(n=3)。在统计受精卵直径时, 从每尾雌鱼所产受精卵中选取30枚进行测量, 计算每个重复中受精卵直径平均值, 初孵仔鱼体长以相同的方法进行统计(n=3)。每尾雌鱼所产胚胎随机选取20枚统计心率, 用于计算每个重复的心率均值(n=3)。孵化率为每个重复中孵化胚胎数占受精卵总数的百分比(n=3)。初孵仔鱼畸形率为每个重复中畸形个体数占总数的比例(n=3)。

1.5 卵母细胞各时相数量统计

未产卵雌鱼卵巢于波恩氏液固定24h后进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明和石蜡包埋等, 将包埋块切至5 μm厚度并进行HE染色, 封片干燥后在光学显微镜下观察并统计第1—5时相卵母细胞的数量,卵母细胞时相划分采用刘敏等[26]方法。对照组和处理组各随机选取6尾雌鱼制作性腺切片(n=6), 每张切片计数视野不少于10个。

1.6 生化指标测定

测定乙酰胆碱酯酶(AChE)、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)及羧酸酯酶(CarE)的活性来评估三唑磷处理后对雌鱼及其子代氧化损伤和解毒酶活性。生化指标测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。分别从每个重复随机选取3尾雌鱼的肝脏(亲代)和20尾初孵仔鱼(子代)进行混样(n=3), 样品按1∶9(重量体积比)加入生理盐水并磨成匀浆, 参照试剂盒说明书测定以上指标。

1.7 统计分析

采用卡方检验比较已产和未产雌鱼数占样本总数比例的差异显著性; 本试验数据均采用均值±标准差(mean±SD)表示, 并使用SPSS 23.0软件以独立样本T检验进行统计分析,P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 雌鱼体重变化与性腺成熟系数

为评估三唑磷暴露21d后对雌鱼生长的影响,测量了暴露期间雌鱼体重增长量以及暴露后雌鱼的性腺成熟系数(GSI)。对照组雌鱼平均增重0.072 g,处理组雌鱼平均增重0.070 g, 两组无显著差异(P＞0.05;图1A)。对照组雌鱼GSI为22.24%, 处理组雌鱼GSI为23.37%, 与对照组相比差异不显著(P＞0.05;图1B)。

图1 三唑磷暴露21d后雌鱼体重增长量和GSIFig.1 Body weight gain and GSI in female fish after 21d of exposure to triazophos

2.2 产卵雌鱼数及其产卵量

如图2所示, 对照组27尾雌鱼中产卵14尾, 未产卵13尾; 三唑磷处理组的产卵雌鱼数为20尾, 7尾未产卵; 卡方检验结果显示, 处理组与对照组间无显著差异(P＞0.05; 图2A)。对照组雌鱼平均产卵数为219.7粒, 而处理组雌鱼产卵数显著增加至250.2粒(P＜0.05; 图2B)。

图2 三唑磷暴露21d后产卵雌鱼数及其对应的产卵量Fig.2 Number of spawning females and their corresponding spawning numbers after 21d of triazophos exposure

2.3 卵巢组织切片各时相卵母细胞数量

为探讨三唑磷暴露对亲代雌鱼卵巢发育是否产生影响, 制作卵巢组织切片并统计各时相卵母细胞数量(图3)。经三唑磷暴露21d后, 处理组第1时相与第2时相卵母细胞数量与对照组相比差异均不显著(P＞0.05)。处理组第3时相的平均卵母细胞数为5.7个, 显著低于对照组(7.5个;P＜0.05)。对照组第4时相的平均卵母细胞数为2.8个, 处理组为3.1个,差异不显著(P＞0.05)。对照组和处理组中第5时相卵母细胞平均数量分别为10和10.7个, 与对照组相比, 处理组第5时相卵母细胞数量显著增加(P＜0.05)。

图3 三唑磷暴露21d后雌鱼卵巢组织切片中Ⅰ—Ⅴ时相卵母细胞数量Fig.3 Number of oocytes in Ⅰ—Ⅴ phase in ovarian tissue sections of female fish after 21d of triazophos exposure

2.4 生化指标

AChE 活性如图4所示, 与对照组相比, 处理组雌鱼肝脏中AChE活性显著降低(P＜0.05; 图4)。对于雌鱼所产仔鱼的AChE活力, 三唑磷处理组AChE活力较对照组有下降趋势, 但差异不显著(P＞0.05; 图4)。

图4 三唑磷暴露21d后雌鱼肝脏及其所产仔鱼AChE活性Fig.4 AChE activity in liver of female fish and their offspring after 21d of triazophos exposure

抗氧化指标通过测定SOD、GPx活性和MDA含量来评估三唑磷暴露对雌鱼及其子代造成的氧化损伤。三唑磷暴露21d后雌鱼肝脏SOD活性显著升高(P＜0.05), 但其子代SOD活性与对照组相比无显著差异(P＞0.05; 图5A)。处理组雌鱼肝脏中MDA含量显著增加(P＜0.05), 在其子代中也发现了类似结果(P＜0.05; 图5B)。与对照组相比, 经三唑磷处理的雌鱼肝脏GPx活力显著增加(P＜0.05), 而其子代GPx活力则显著降低(P＜0.05; 图5C)。

图5 三唑磷暴露21d后雌鱼肝脏及其所产仔鱼部分抗氧化指标的变化Fig.5 Changes of some antioxidant indices in liver of female fish and their offspring after 21d of triazophos exposure

解毒酶活性GST和CarE的活性被用来评估雌鱼及其子代对三唑磷的解毒能力。与对照组相比, 处理组雌鱼肝脏中检测到GST活性显著升高(P＜0.05), 然而其仔鱼中GST活性显著降低(P＜0.05;图6A)。与对照组相比, 在三唑磷暴露后, 雌鱼及其仔鱼CarE活性显著提高(P＜0.05; 图6B)。

图6 三唑磷暴露21d后雌鱼肝脏及其所产仔鱼的解毒酶活性Fig.6 Detoxification enzyme activity in the liver of female fish and their offspring after 21d of triazophos exposure

2.5 胚胎发育相关指标

检测子代胚胎心率、仔鱼孵化率和畸形率等作为评估三唑磷暴露雌鱼后对所产子代的发育毒性指标。与对照组相比, 三唑磷处理后雌鱼所产胚胎受精率显著降低(P＜0.05; 表1), 受精卵直径显著减小(P＜0.05; 表1)。对照组胚胎平均心率为110.1次/min, 而处理组胚胎平均心率显著下降(103.2次/min,P＜0.05; 表1)。处理组胚胎孵化率与对照组相比无差异(P＞0.05; 表1)。与对照组相比, 处理组初孵仔鱼体长显著缩短(P＜0.05; 表1), 仔鱼畸形率高于对照组7.2倍(P＜0.05; 表1), 处理组仔鱼畸形如图7,主要表现为脊柱弯曲及卵黄囊肿大。

表1 雌鱼所产子代胚胎发育相关指标Tab.1 Related indicators of embryo development of offspring produced by female fish

图7 雌鱼暴露于三唑磷21d后所产仔鱼畸形图Fig.7 Malformation of larvae when their parent female exposed to triazophos for 21d

3 讨论

3.1 三唑磷暴露对受试动物生殖的影响

本研究中环境浓度三唑磷暴露21d后雌鱼体重增长量与性腺成熟系数(GSI)无显著变化, 但雌鱼产卵量显著增加(图2B)。通过观察卵巢组织切片来进一步探讨雌鱼产卵量增加是否与卵巢中成熟期卵母细胞的数量有关, 结果显示处理组成熟期卵母细胞数量与对照组相比显著增加(图3)。在三唑磷的靶标生物上发现类似的结果, 如三唑磷暴露对三种飞虱产卵有显著的刺激作用[23], 导致褐飞虱的繁殖力增强[27]。但也有研究表明三唑磷降低受试动物的生殖力, 如雌性大鼠孕前口服三唑磷30d后产仔数略有降低, 幼崽在30d发育过程中体重减轻[22]。本研究表明环境相关浓度三唑磷暴露增强雌鱼的产卵量, 这与飞虱上的研究结论相似, 却与大鼠的研究结果相反, 这可能是物种差异导致。

3.2 三唑磷暴露对AChE、氧化应激和解毒相关生化指标的影响

乙酰胆碱酯酶(AChE)是以三唑磷为代表的有机磷农药的作用靶酶。三唑磷通过抑制中枢和周围神经系统中的AChE来发挥其作用[28]。据报道,三唑磷暴露可抑制鲤(Cyprinuscarpio)脑内AChE 活性, 且抑制作用会随着暴露浓度的升高而增强[29];三唑磷对金鱼(Carassius auratus)脑、脾、肾和肝脏组织中AChE活性的抑制作用随浓度的升高逐渐增强[16];三唑磷暴露雄性翡翠贻贝(Pernaviridis)15d后, 鳃中AChE活力显著降低[30];稀有鲫胚胎和仔鱼体内AChE活性对三唑磷的响应呈低剂量促进高剂量抑制的模式[17]。本研究中三唑磷暴露21d后雌鱼肝脏AChE活力显著降低, 仔鱼AChE活力也出现下降趋势(图4), 表明三唑磷对雌鱼及所产仔鱼造成了不同程度的神经毒性。

MDA常被用作评估水生生物在毒物暴露下氧化应激状态的有效生物标志物,以反映细胞和组织的损伤水平[31]。本研究中三唑磷暴露导致雌鱼肝脏及其所产仔鱼MDA含量显著增加(图5B), 表明雌鱼肝脏及其所产仔鱼均遭受氧化损伤。生物体内存在多种机制保护机体免受外来物质造成的应激, 如抗氧化物。SOD-CAT系统提供了抵抗氧化应激的第一道防线,其中SOD催化超氧阴离子自由基()和H+分别转化为无毒的H2O2和O2,CAT则将H2O2分别转化为无毒的H2O和O2[32,33]。在抗氧化过程中,GPx也发挥了关键作用,其主要以过氧化物为底物,将其催化还原为O2和H2O[34]。本研究结果显示三唑磷暴露后雌鱼肝脏SOD和GPx活性显著提高(图5A和5C), 提示机体抗氧化系统产生了应答, 从而保护机体免受氧化损伤。前人也报道过类似结论, 经有机磷农药毒死蜱暴露后凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体内MDA含量上升, GPx活性显著提高[35], 高浓度毒死蜱诱导翠鳢(Channa punctata)体内MDA增加, SOD和GPx活力增强[36]。值得注意的是, 本文在仔鱼体内却观察到GPx活性显著下降, SOD活性也呈下降趋势(图5A和5C)。据报道, 三唑磷对稀有鲫胚胎和仔鱼酶活性的作用特征是低剂量刺激转变为高剂量抑制[17]。在本试验中仔鱼酶活性变化与雌鱼相反可能是由于仔鱼对三唑磷更为敏感, 三唑磷暴露亲代雌鱼导致所产仔鱼抗氧化系统受损, 氧化平衡被打破。另外,研究指出三唑磷暴露会造成金鱼体内的组织特异性抗氧化反应[16], 本研究测定抗氧化指标时, 雌鱼选取肝脏进行测定, 仔鱼由于肝组织精准取样困难则是全鱼匀浆, 出现差异的原因也可能与组织特异性抗氧化反应有关。

生物体内存在多种解毒酶以维持机体正常生命活动, GST作为一种生物转化酶, 可催化谷胱甘肽(GSH)与多种亲电物质或异种生物偶联反应, 具有抗外来生物的活性, 从而保护组织免受氧化应激[37—39]。CarE是生物体内重要的解毒酶和代谢酶,它以水解和结合蛋白两种方式对杀虫剂解毒, 尤其对有机磷类杀虫剂的代谢作用明显[40]。在本研究中, 三唑磷暴露后雌鱼肝脏GST和CarE活性显著提高(图6A和6B), 表明机体对三唑磷造成的毒性产生了响应, 解毒酶积极参与了对三唑磷的解毒过程。在仔鱼中同样观察到CarE活性提高(图6B), 表明仔鱼对三唑磷的解毒也产生了响应; 与之相反,仔鱼GST活性下降(图6A)。前人研究表明三唑磷对稀有鲫胚胎和仔鱼GST活性影响呈低浓度促进、高浓度抑制的趋势[17], 在本研究中仔鱼GST活性下降可能的原因是仔鱼对于三唑磷更为敏感, 较低剂量的环境浓度三唑磷暴露亲代雌鱼抑制仔鱼GST活性。此外, 研究表明, 一些鱼类对外来物的反应过程中GST活性变化与GSH含量密切相关[41],如一种鮰(Ictalurus melas)汞暴露后观察到GSH含量增加, 但GST活性降低[42]。本研究中三唑磷暴露后雌鱼及所产子代GST活性变化的原因可能与GSH含量有关, 这需要进一步研究确定。

3.3 毒物暴露对胚胎发育的影响

许多研究证明毒物会导致受试动物发育异常。据报道, 大鼠口服三唑磷后其子代观察到步态受损、前后肢瘫痪和发育过程中体重减轻等[22]。两种杀虫剂暴露21d后导致大型溞(Daphnia magna)体长缩短[43]。有机汞暴露导致斑马鱼仔鱼眼睛发育异常、脊柱畸形和尾鳍弯曲[44], 汞短期暴露胚胎导致牙鲆(Paralichthys olivaceus)仔鱼出现各种畸形[31]。高浓度三唑磷暴露草鱼胚胎导致受精卵严重畸形和死亡、仔鱼无法正常生存[18]。三种六色环十二烷暴露会造成斑马鱼胚胎心率降低, 导致仔鱼畸形率和死亡率增加[45]。在三唑磷72h急性暴露后, 稀有鲫胚胎及仔鱼死亡率和畸形率随暴露浓度的增加而增加, 体长和心率随暴露浓度的增加而逐渐降低[17]。在本试验中, 经三唑磷暴露的雌鱼所产子代中受精卵直径减小、胚胎心率降低、初孵仔鱼体长缩短及仔鱼畸形率上升(表1), 这与前人探究毒物对胚胎和仔鱼毒性的研究结果相似[17,18,31,44,45]。本研究还观察到雌性斑马鱼经环境相关浓度的三唑磷暴露后胚胎受精率降低(表1),表明对其所产子代也造成明显毒性。在本研究中,环境浓度三唑磷暴露亲代雌鱼造成子代的氧化应激, 推测子代胚胎发育不良可能是三唑磷诱导氧化应激造成的, 这需要进一步研究证实。此外, 本研究中三唑磷暴露后雌鱼体重与GSI并无显著变化,但雌鱼产卵量却显著提高, 值得注意的是, 子代受精卵直径与初孵仔鱼体长显著减小, 可能原因是当亲代雌鱼在应对污染物暴露胁迫的过程中, 通过增加子代数量及幼仔个体变小来维持稳定的种群数量。

4 结论

综上所述, 本研究表明环境相关浓度三唑磷暴露亲代雌性斑马鱼可提高雌鱼的产卵量, 抑制雌鱼肝脏及所产仔鱼体内AChE活性, 诱导雌鱼肝脏及其所产仔鱼氧化应激并提高雌鱼和仔鱼体内解毒酶活性。此外, 亲代雌性斑马鱼暴露于三唑磷导致其所产子代胚胎畸形、个体变小和心跳变缓等不良反应。本研究结果积累了三唑磷对鱼类的生殖毒性的基础数据, 可为合理评估三唑磷对淡水生态系统风险提供参考依据。