绵羊源溶血性曼氏杆菌A2型的分离鉴定及耐药性分析

梁纤纤，郑启铭，李晓卓，冯继红，李 月，刘文锴，韩翔舒，阿卜杜热合曼·努尔麦麦提，苏战强*，夏 俊*

（1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830000；2.新疆昌吉呼图壁县农业农村局，新疆 昌吉 831100；3.新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，乌鲁木齐 830000；4.农业农村部草食动物疫病防控重点实验室（省部共建），乌鲁木齐 830000；5.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832061）

溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，MH）是巴氏杆菌科曼氏杆菌属的革兰氏阴性菌，寄生在反刍动物的上呼吸道中，能够导致动物肺炎乃至死亡，属于条件性致病菌，宿主常常在断奶、恶劣天气、运输等应激情况下发病[1]。MH共分12个血清型，临床分离株主要以A1、A2、A6为主[2]，A1通常在牛呼吸道检出，而A2、A6为感染羊的主要血清型[3]。由MH引起的牛、羊等反刍动物的呼吸道疾病具有较高发病率和死亡率，给我国乃至全世界的养殖产业造成严重的经济影响[4]。国内外关于溶血性曼氏杆菌病的报道较多，也有学者进行关于MH 的灭活疫苗的研究，但由于各血清型之间交叉免疫保护性较低，疫苗的免疫谱窄，疫苗保护效果不理想，目前该病仍缺乏有效的防治手段[5，6]。本研究采集病死绵羊肺脏组织进行细菌分离鉴定、病原学研究、小鼠致病性分析和药敏试验，为后续MH的实验室诊断及疫苗的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

阿勒泰地区某羊场部分羊只出现咳嗽气喘、精神萎靡、体温升高等临床症状，病死羊只剖检可见肺脏严重充血。送检病死绵羊肺脏组织4份。

1.1.2 主要材料

马丁肉汤培养基购自青岛海博生物技术有限公司；革兰氏染色试剂盒购自索莱宝科技有限公司；DL2000核酸Marker购自赛国生物科技有限公司；药敏片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.3 试验动物

18～22 g健康雌性BALB/c小鼠12只，购自新疆维吾尔自治区疾病预防与控制中心实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养与纯化

在超净工作台中严格无菌操作，将肺脏组织接种于马丁肉汤琼脂培养基中，37 ℃恒温培养过夜。过夜培养后挑取半透明状单菌落再次接种于马丁肉汤液体培养基中，37 ℃恒温培养16～18 h，观察生长情况，并将纯化培养后的细菌进行革兰氏染色，镜检观察其形态。

1.2.2 PCR鉴定及血清型鉴定

使用文献建立的MH特异性[7]PCR 方法进行鉴定，经鉴定后采用KLIMA等[8]建立的MH A1、A2和A6 血清型特异PCR 方法，对MH 血清型进行鉴定，引物序列如表1。反应体系为常规50 μL，瞬离后混合均匀置于PCR 扩增仪中，反应条件为95 ℃预变性3 min，94 ℃循环变性30 s，退火温度为58 ℃复性20 s，72 ℃延伸1 min，共进行30个循环，72 ℃终延伸5 min，最后于4 ℃保存。配制1%琼脂糖凝胶进行电泳，参照DNA 2000 Marker，判断产物的序列大小是否与目标值一致。PCR扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果于NCBI进行BLAST。

表1 引物序列

1.2.3 药敏试验

采用K-B 纸片法检测MH 分离株对20 种抗菌药物包括青霉素、氨苄西林、头孢唑林、头孢他啶、头孢哌酮、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四环素、阿奇霉素、林可霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、多黏菌素B、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明进行敏感性测定。吸取200 μL细菌纯培养物，均匀涂布于马丁肉汤琼脂培养基上，吸收5 min 后，将药敏片等距贴于培养基上进行药敏试验。于37 ℃恒温培养18 h后判定结果，药敏结果判定按CLSI标准。

1.2.4 小鼠致病性试验

使用活菌计数法测得该分离株的含菌量为1.664×109CFU，将12只小鼠随机分为两组，A组每只腹腔注射0.2 mL 分离株纯培养物，B 组每只腹腔注射相同剂量的无菌PBS。观察小鼠精神状态，如出现死亡，立即剖检观察肺脏病理变化，并采集死亡小鼠心血及肺脏组织进行细菌分离培养及鉴定。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养与纯化

将肺脏组织接种于马丁肉汤培养基恒温培养后，可见露滴状、表面光滑、边缘整齐、呈正圆形的半透明菌落，挑取单菌落接种马丁肉汤液体培养基恒温培养后，进行革兰染色，镜检可见短杆状、粉红色两端钝圆的革兰氏阴性菌。见图1，图2。

图1 马丁肉汤琼脂培养基培养结果

图2 革兰氏染色镜检（物镜100×）

2.2 PCR鉴定及血清型鉴定

细菌纯培养物经MH 特异性PCR 扩增后获得约206 bp 大小目的条带，见图3，再进行血清型鉴定，得到约106 bp大小目的条带，见图4，与血清A2型目的条带大小相符，因此判定该分离株为A2型菌株。

图3 分离株特异性PCR鉴定结果

图4 分离株血清型PCR鉴定结果

2.3 致病性试验

试验组6 只小鼠注射菌液6 h 后开始出现精神萎靡，眼部分泌红黄色炎性物质，排黄色混浊尿液，随后几小时内陆续出现死亡，15 h内全部死亡。对照组小鼠24 h内全部存活，无异常表现。将死亡小鼠剖检，采集心血和肺脏组织进行细菌分离鉴定，与MH相符。

2.4 药敏试验

药敏结果如图5、图6所示，该分离株对青霉素、头孢唑林、氨苄西林敏感；对包括头孢他啶、头孢哌酮、链霉素、庆大霉素、阿奇霉素、多黏菌素B、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、氟苯尼考、克林霉素、林可霉素、阿米卡星、氯霉素、四环素、卡那霉素在内的17种抗菌药物耐药。

图5 药敏试验1

图6 药敏试验2

3 讨论与结论

随着新疆养羊业的蓬勃发展，养殖规模不断扩大，羊患病的风险也日益突出，尤其是羊呼吸系统疾病，主要由支原体、巴氏杆菌和曼氏杆菌引起。曼氏杆菌不仅能使羔羊发病，也能感染成年羊，一旦发病，病羊则会消瘦、咳嗽气喘，严重者还会死亡，制约了新疆养羊业的发展。国内外关于牛曼氏杆菌的报道很多，关于羊的研究却不够全面。目前有学者研究关于羊曼氏杆菌的灭活疫苗，临床使用效果却不佳，可能是由于血清型不同，难以达到交叉保护的效果，要制备具有交叉保护效果的疫苗，关于曼氏杆菌血清型的研究必不可少。聂荷莲[9]等的研究中说明溶血性曼氏杆菌A2型的主要来源是羊，江苏地区的溶血性曼氏杆菌A2 型也是来源于羊。本研究从新疆地区的绵羊中也分离到了溶血性曼氏杆菌A2型，为后续曼氏杆菌的研究和疫苗制备提供参考。

本研究中的分离株仅对青霉素、头孢唑林、氨苄西林敏感，对其他头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类、多肽类、喹诺酮类、磺胺类、氯霉素类、林可酰胺类、四环素类等多种抗菌药耐药，可能是由于新疆地区治疗溶血性曼氏杆菌病仅依靠抗菌药物，导致多重耐药性的产生。郜敏[10]等的研究显示四川MH分离株链霉素、阿奇霉素、头孢氨苄、恩诺沙星和头孢噻吩耐药，其中复方新诺明耐药性最强。本研究耐药性的结果与该研究基本一致，但与冯旭飞[4]等报道中MH 分离株对四环素、氟苯尼考、氧氟沙星、恩诺沙星等大部分药物敏感的结果存在很大差异，可能由于养殖过程中大量使用相关抗菌药物有关。本研究中的MH存在多重耐药性，可为后续MH耐药基因的研究提供参考，本研究药敏试验结果也说明该养殖场对于溶血性曼氏杆菌病的治疗用药情况需要改进。