广西芒果细菌性坏死病病原菌鉴定

陈小林 孙秋玲 黄穗萍 唐利华 郭堂勋 莫贱友 任惠 李其利

摘要

芒果Mangifera indica L.是我國著名的热带水果，近年来细菌性病害发生严重。2020年－2021年对广西百色地区的芒果病害进行调查发现，一种细菌性坏死病与细菌性黑斑病混合发生，一般发病率30%～60%，严重可达90%以上。本研究先后从该地区不同芒果坏死病组织中分离得到泛菌属的21株细菌。根据形态、生理生化特性、16S rDNA、fusA、gyrB、leuS、pyrG、rlpB和rpoB的多基因系统发育分析、致病性测定等方法将21个菌株分别鉴定为Pantoea vagans、P.anthophila、P. dispersa 和P. cypripedii。其中P.anthophila、P. dispersa 和P. cypripedii引起芒果细菌性坏死病是中国首次报道。

关键词

芒果; 细菌性坏死病; 泛菌属

中图分类号：

S 432.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022772

Identification of the pathogen causing mango bacterial necrotic disease in Guangxi

CHEN Xiaolin1， SUN Qiuling1， HUANG Suiping1， TANG Lihua1， GUO Tangxun1，MO Jianyou1， REN Hui2*， LI Qili1*

（1. Institute of Plant Protection， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Key Laboratory of Green Prevention 

and Control on Fruits and Vegetables in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Guangxi Key 

Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests， Nanning 530007， China; 2. Institute of Horticulture， 

Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China）

Abstract

Mangifera indica L. is one of the wellknown fruits in China. Bacterial diseases have been occurring seriously in recent years. A bacterial necrotic disease mixed with bacterial black spot disease on mango was observed， with an incidence rate of 30%-60%， even up to 90%， in our investigation of mango diseases in Baise， Guangxi from 2020 to 2021. Twentyone isolates belonging to the genus Pantoea were successively isolated from the mango necrotic tissues in investigation region in this study. The isolates were identified as four species： Pantoea vagans， P.anthophila， P. dispersa and P. cypripedii based on the morphological， physiobiochemical characteristics， 16S rDNA sequence， phylogenetic analysis of fusAgyrBleuSpyrGrlpBrpoB concatenated sequences and pathogenicity test. This is the first report of necrotic disease caused by P.anthophila， P. dispersa and P. cypripedii in mango in China.

Key words

Mangifera indica; bacterial necrotic disease; Pantoea

芒果Mangifera indica L.是著名的热带果树，主要种植于印度、中国和泰国等热带和亚热带国家［12］。2020年广西芒果种植面积11.2万hm2，产量近95万t，为我国第一大芒果产区［3］。随着品种结构改变和气候变化，芒果细菌性病害发生日益增多，近年呈加重趋势，严重影响芒果产量和品质，制约广西芒果产业健康发展［4］。

已报道引起芒果细菌性病害的病原菌，主要包括引起芒果细菌性黑斑病（又称芒果细菌性角斑病）的柑橘黃单胞菌芒果致病变种Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae［56］，引起芒果细菌性顶端坏死病的丁香假单胞菌Pseudomonas syringae pv. syringae［7］，引起芒果叶斑病的树生黄单胞菌X.arboricola［8］，引起芒果细菌性干枯病的血红鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanguinis［910］和引起芒果细菌性坏死病的泛菌属细菌Pantoea ananatis［11］、P.agglomerans［12］ 和P.vagans［13］等种类。

2020年－2021年对广西芒果主产地百色田东县、田阳县、右江区和田林县不同果园的病害进行调查，发现芒果上发生一种类似于细菌性黑斑病的坏死病，两者常混合发生，一般株发病率30%～60%，严重时可达90%以上。为明确该病害的病原菌，本研究对田间采集的病害样品进行病原菌的分离、纯化、培养，并采用形态学观察和生理生化特性、致病性测定、多基因系统发育分析等方法对分离物进行鉴定，旨在明确广西细菌性坏死病的病原菌种类和优势种群，为深入研究其发生规律和防治技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 病害调查及病样采集

2020年－2021年在广西芒果主产地百色地区不同种植区（田东县、田林县、田阳县和右江区）采集不同品种芒果上类似细菌性黑斑病的坏死病样品。

1.2 病原菌的分离与纯化

选取叶片或果实病样，切取病健交界处组织（5 mm×5 mm），75%乙醇浸泡10 s，2%次氯酸钠浸泡1 min，灭菌水冲洗3次，置于研钵中，加入少量石英砂和1 mL灭菌水进行充分研磨，吸取100 μL上清液至分装有900 μL灭菌水的1.5 mL离心管进行系列梯度稀释，吸取10-3～10-6梯度各100 μL涂布于LB固体平板上，28℃恒温培养箱中培养，每份样品选择不同菌落形态的代表性菌株1株进行保存。

1.3 病原菌鉴定

1.3.1 菌株的分子生物学鉴定

将分离菌株在LB液体培养基中培养24 h，采用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取菌株总DNA。利用细菌16S rDNA的通用引物27F（5′GAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）和1492R（5′CGGCTACCTTGTTACGACTT3′）对36株供试菌株基因组DNA进行PCR扩增［14］。20 μL PCR反应体系：2×PCR buffer （plus Mg2+）10 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.5 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.1 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR反应条件为94℃预变性3 min;94℃变性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸5 min。泛菌多位点序列包括延伸因子EFG基因（fusA）、DNA促旋酶基因（gyrB）、亮氨酰tRNA合成酶基因（leuS）、CTP合成酶基因（pyrG）、脂蛋白基因（rlpB）和RNA聚合酶β亚基基因（rpoB）的扩增引物信息、退火温度及扩增产物大小见表1［15］。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶检测条带后，产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果提交NCBI在线网站进行相似性比对，使用MEGA X的最大似然法构建系统发育树，确定近缘细菌菌株的分类地位。

1.3.2 形态与生理生化特性鉴定

将分离菌株接种于LB固体培养基上，28℃培养2 d，观察菌落形态、大小、颜色、表面及边缘形态、透明度等特征;对细菌进行革兰氏染色，观察染色结果。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版）进行生理生化特性测定：3%耐盐性、氧化酶和过氧化氢酶活性、硝酸盐还原试验、淀粉水解、明胶液化、硫化氢的产生以及碳源（蔗糖、D果糖、葡萄糖、α半乳糖、麦芽糖和甘露醇）利用等。

1.4 菌株的致病性测定

每个种选取代表性菌株1株进行致病性测定。将菌株接种于LB液体培养基28℃培养过夜，收集菌体，无菌水重悬并调节OD600=0.1。选取‘玉文’芒果新梢上的健康叶片，用无菌注射器针头对叶片进行轻微刺伤后，将灭菌脱脂棉蘸取菌液接种于叶片背面，28℃保湿培养48 h。以接种本研究分离的芒果细菌性黑斑病菌为对照，无菌水为空白对照。定时观察记录发病情况。采用相同的方法对‘玉文’芒果果实进行离体接种，测定菌株致病性。果实接种前依次用75%乙醇清洗10 s，2%次氯酸钠1 min，无菌水清洗3次，晾干，然后采用无菌注射器针头对4个位置进行刺伤，每个位置刺伤8个伤口，将灭菌脱脂棉蘸取菌液接种于刺伤位置，28℃保湿培养48 h。对接种后发病的芒果组织进行病原菌再分离、纯化与鉴定，完成柯赫氏法则验证。空白对照采用同样的方法进行处理。

2 结果与分析

2.1 病害调查与病原菌分离

2020年－2021年间田间调查发现，广西百色田东县、田阳县、右江区和田林县不同果园的芒果上发生一种类似于细菌性黑斑病的坏死病。叶片感病初期产生水渍状小点，后期逐渐扩展成多角形或不规则形状的黑褐色病斑，周围伴有黄晕圈（图1a～e）;果实感病初期主要表现为褐色小点，后期扩展成表面隆起的黑褐色病斑，严重时病斑溃疡开裂且有汁液溢出（图1f～j）。先后从不同果园采集病害样本28份，经组织表面消毒、研磨和稀释分离，每份样品选择不同菌落形态的代表性菌株1株进行保存，共获得36株细菌（表2，图1k～o）。

2.2 菌株的分子生物學鉴定

利用细菌通用引物27F/1492R对菌株的16S rDNA序列进行扩增、测序，将获得的序列在NCBI进行BLASTn同源性比对。对36个供试菌株16S rDNA序列进行系统发育分析，结果表明，36个菌株中，15个菌株的16S rDNA序列与芒果细菌性黑斑病菌的相应序列一致性最高，达99.5%以上，与黄单胞菌属不同种聚在一个大分支，另外21个菌株的16S rDNA序列与泛菌属Pantoea的相应序列一致性最高，达99%以上，与泛菌属不同种聚在另一个大分支（图2）。进一步克隆、测序泛菌属21个菌株的6个基因片段（fusA、gyrB、leuS、pyrG、rlpB和rpoB），并进行BLASTn同源性比对。利用MEGAX软件的最大似然法（maximum likelihood，ML）构建6个基因串联序列的系统发育树（图3）。

结果表明，以Tatumella terrea为外群，21个菌株分别聚在4个不同的分支，被鉴定为4个种：P.vagans、P.anthophila、P.dispersa和P.cypripedii。其中， 8个菌株为P.vagans，占比38%，是优势种。菌株的分离和鉴定结果表明，同一样品存在泛菌属不同种或泛菌属与细菌性黑斑病菌混合发生的情况（表2）。

2.3 菌株的形态和生理生化特性

泛菌属4个种的供试菌株具有以下共同的特征：菌落黄色，均为革兰氏阴性菌，能在3%盐浓度下生长，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，不能还原硝酸盐，可以降解淀粉，能利用蔗糖、D果糖、葡萄糖、α半乳糖、甘露醇作为碳源。此外，4个种供试菌株均不具有明胶液化能力，但可以产生硫化氢;除P. vagans，泛菌属其他3个种均可以利用麦芽糖作为碳源;除P.cypripedii外，其他3个种甲基红反应均为阳性（表3）。

2.4 致病性测定

分别选取4个种的代表性菌株各1株进行致病性测定。对‘玉文’芒果新梢上的健康叶片采用刺伤接种供试菌悬液，28℃保湿培养48 h。结果显示，接种5 d后，叶片开始出现针状褐色小点，接种15 d后，不同种菌株接种叶片的发病程度不同，但发病症状与田间自然发病的症状基本一致（图4a～f）。采用相同的方法对‘玉文’果实离体接种进行菌株致病性测定。结果显示，接种果实7 d后，发病症状与田间自然发病的症状相似（图4g～l）。从发病组织中重新分离病原菌，经纯化和分子鉴定，分离到与供试菌株同种细菌，验证了科赫氏法则。

3 结论与讨论

本研究通过形态学、生理生化特性、分子鉴定与致病性测定的方法明确了广西百色芒果细菌性坏死病的4种病原菌属于泛菌属，其中优势种为Pantoea vagans，占比38%。其次为P.anthophila、P.cypripedii和P.dispersa。目前芒果上已相继报道泛菌属P.ananatis、P.agglomerans和 P.vagans为芒果细菌性坏死病的病原菌［1113］。本研究为国内外首次报道泛菌属P.anthophila、P.dispersa和P.cypripedii引起芒果细菌性坏死病。2020年和2021年的调查发现，该病害在广西百色发生普遍，且常与芒果细菌性黑斑病混合发生，容易被忽略或混淆，值得进一步关注。

植物病原细菌传统的分类依据主要是表型特征和生理生化特性，前者包括菌落形态、细菌革兰氏染色观察、致病性等。由于有些重要分类特征的重叠和环境的影响，遗传关系较近的小种、亚种及致病变种等往往难以区分，给病原菌的快速准确鉴定带来诸多困难［16］。本研究中生理生化特性结果也证实其无法有效区分泛菌属4个不同种。随着分子生物学的快速发展，现代细菌分类已进入多相分类（polyphasic taxonomy）阶段［17］。16S rRNA的基因序列是细菌分类鉴定的强有力工具，几乎可以对所有的细菌进行属水平上的鉴定［1819］，但由于其保守性高，不太适合种或某些近缘种的鉴定。本研究中基于16S rDNA序列能将36株菌株进行属水平的区分，但无法在种水平上进行有效鉴定。目前，基于fusA、gyrB、leuS、pyrG、rlpB和rpoB多位点序列分析被广泛应用于泛菌属细菌的分类鉴定研究中，其快速准确、重复性好，在细菌的分类鉴定中具有独特优势［15］。本研究结果也表明，基于fusA、gyrB、leuS、pyrG、rlpB和rpoB多基因序列能有效区分泛菌的不同种。

泛菌属是一类基因组高度可塑的革兰氏阴性肠杆菌科细菌，广泛存在于水体、土壤及动植物等多种环境，目前至少包括25个种和2个亚种［20］。很多泛菌属菌株是植物病原菌，可引起植物结瘤、萎蔫、软腐或坏死等症状［12， 2122］。植物病原细菌主要是通过自然孔口或伤口入侵植物组织［23］。本研究在进行菌株致病性测定时采用刺伤接种，发现不同菌株致病性强弱存在差异，这些病原菌能否从自然孔口侵入有待进一步的研究。本研究明确P.anthophila、P.dispersa和P.cypripedii引起芒果细菌性坏死病，为后续研究该病害的发生流行学奠定基础，为制定有效的防控策略提供理论依据。

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