红花龙胆枯萎病病原菌鉴定及培养特性研究

严凯 李树江 李敏 张晓勇

摘要

枯萎病是红花龙胆栽培中发生最普遍，危害最严重的病害之一。为明确引起红花龙胆枯萎病的病原种类及其侵染特性，本研究采用组织分离法获得2个菌株，结合形态学特征以及ITS和Mcm7序列鉴定， 2個菌株被鉴定为Clarireedia jacksonii，这是该菌在龙胆科植物上引起枯萎病的首次报道。致病性测定表明，该菌在15～35℃可侵染红花龙胆健康叶片，最佳侵染温度为25℃。生长特性研究表明，该菌最适生长温度为25℃，最适pH为5，菌丝致死温度为50℃处理10 min。

关键词

红花龙胆; 枯萎病; 病原菌鉴定; 侵染特性; 生长特性

中图分类号：

S 435.672

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022646

Identification and biological characteristics of Clarireedia jacksonii causing wilt disease on Gentiana rhodantha in Guizhou

YAN Kai， LI Shujiang， LI Min， ZHANG Xiaoyong*

（School of Biological Science and Technology， Liupanshui Normal University， Liupanshui 553004， China）

Abstract

Wilt disease is one of the most common and serious diseases of Gentiana rhodantha in the field in Guizhou province. In order to identify the pathogen causing wilt disease on G.rhodantha， two strains were isolated from diseased leaves by tissue separation method. Based on morphological characteristics and analyses of ITS and Mcm7 sequences， the pathogen was identified as Clarireedia jacksonii. This is the first report of C.jacksonii causing wilt disease on Gentianaceae plants. Pathogenicity test showed that the pathogen could infect the healthy leaves at 15-35℃， and the optimal infection temperature was 25℃. In culture tests， the optimum conditions for mycelial growth were 25℃ and pH 5， and the lethal temperature for mycelium was 50℃ for 10 min.

Key words

Gentiana rhodantha; wilt disease; pathogen identification; infection characteristics; culture characteristics

红花龙胆Gentiana rhodantha是龙胆科Gentianaceae的多年生草本植物，分布在我国四川、陕西、广西、云南、河南、甘肃等地区，全草可入药，具有较高的药用价值［1］。红花龙胆一般通过种子穴盘育苗和组织培养，种植2～3年可采收，采收时间一般在每年的8月－10月［23］。由Pestalotiopsis trachicarpicola引起的叶斑病（leaf spot）常给红花龙胆生长造成严重影响，该病早期在红花龙胆叶片的中部或叶缘形成淡黄色小斑，之后迅速扩大至圆形或椭圆形大斑，病斑周围有紫色晕圈，最终叶片全部干枯［4］。近年来在贵州红花龙胆栽培田间普遍发生枯萎病（wilt disease），该病主要在6月－9月高温季节发生，从移栽的幼苗到成熟植株各个发育阶段均能染病，一年生小苗发病尤为严重，病株近基部大段茎秆和叶片坏死，地上部分干枯，植株不倒伏，形成典型的枯萎症状。目前红花龙胆枯萎病还未见报道，病原菌也尚不明确，不利于该病的田间识别和防控。

为明确红花龙胆枯萎病传播、发病规律及病原菌种类，本文采用形态学结合多基因分子生物学鉴定的方法对病原菌进行鉴定，并对病原菌生物学特性和侵染特性进行研究，旨在为红花龙胆枯萎病的田间识别及防治提供理論及实践参考。

1 材料与方法

1.1 病害标本采集与病原菌分离纯化

供试的红花龙胆枯萎病典型病害材料于2020年8月采自贵州省六盘水市水城区杨梅乡台沙村（104°50′E， 26°35′N，海拔2 158 m）。采用组织分离法对患病叶片进行病原菌分离和纯化。纯化菌株在PDA斜面上培养7～10 d后置于4℃保存备用。

1.2 病原菌的鉴定

1.2.1 形态学鉴定

菌种在PDA平板活化后，在菌落边缘打取4 mm菌饼，分别接种于PDA平板中央，在25℃、自然光照下培养3 d 后观察菌落形态，以十字交叉法测量菌落直径（mm），重复3次。并将菌株接种于含2.5 mmol/L 乙酸的PDA平板中，于25℃、连续光照条件下培养20 d诱导菌株的不育子囊盘［5］，并用无菌水制备装片于显微镜下观察菌丝及不育子囊盘的形态特征。

1.2.2 分子生物学鉴定

菌株接种于PDA平板上，于25℃的恒温培养箱中培养4 d后刮取菌丝，用改良的CTAB法提取菌株DNA［6］。扩增内转录间隔区ITS （rDNA internal transcribed spacer）和DNA复制准许因子基因Mcm7 （DNA replication licensing factor）序列。ITS引物选用ITS4 （5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）和ITS5（5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′）;Mcm7的引物选用Mcm7709 for （5′ACIMGIGTITCVGA

YGTHAARCC3′）和Mcm71348rev（5′GAYTTDGCIACICCIGGRTCWCCCAT3′） ［78］。采用25 μL PCR反应体系：正、反向引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，超纯水8.5 μL。

扩增ITS的PCR反应条件为：95℃预变性2 min;95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环;72℃延伸2 min。扩增Mcm7的PCR反应条件为：94℃预变性10 min;94℃变性40 s，56℃退火50 s，72℃延伸60 s，38个循环;72℃延伸5 min［78］。扩增产物由北京擎科生物科技有限公司进行纯化和测序。

将所得的ITS、Mcm7序列与 GenBank中菌株所对应的基因序列用MEGA 11比对，用Sequence Matrix 1.7.8 软件拼接，最后在MEGA 11软件中用极大似然法（maximum likelihood）构建系统发育树，确定菌株的分类地位，系统发育树各个分支的支持强度通过1 000次重复自展检验数值进行评估。

1.3 致病性测定

取新鲜、健康、无损伤的带3～4片成熟叶片的红花龙胆枝条，用75%乙醇擦拭叶片，无菌水轻轻冲洗3次，无菌吸水纸吸干水珠后放置于超净工作台中晾干表面水分。枝条切口处用无菌湿棉球包裹后平置于培养皿内保湿培养。用灼烧冷却的针头在叶片上集中打取4个小针孔进行微损伤处理，设置不损伤接种处理，取1块直径2 mm菌块接种于微伤口处，并在未损伤处理叶片相同部位接种菌块，菌丝面紧贴叶片，以在损伤部位接种相同大小PDA培养基为对照，每处理6片叶片，重复3次，于25℃、连续光照的培养箱中培养3 d后观察叶片的发病情况，统计发病率，并用游标卡尺以十字交叉法测量病斑大小。

1.4 病原菌适宜生长温度及pH测定

打取4 mm菌饼接于PDA平板中央，分别在0、5、10、15、20、25、30、35℃和40℃，培养箱中培养3 d后通过十字交叉法测量菌落直径（mm），重复3次。

用0.1 mol/L的HCl或NaOH将PDA培养基的pH调为4、5、6、7、8、9、10和11等8个pH梯度，灭菌后备用。打取4 mm菌饼接到培养基中央，并在25℃、自然光照培养箱中培养3 d后以十字交叉法测量菌落直径（mm），重复3次。

1.5 病原菌致死温度测定

取直径4 mm菌饼装入盛有1 mL无菌水的2 mL离心管中，分别在30、40、42、45、47、50℃和55℃恒温水浴中加热10 min。待试管冷却后取出菌饼，无菌滤纸吸干表面水珠后接种于PDA平板中央，在25℃培养3 d后观察菌落生长情况。重复3次。

1.6 病原菌最适侵染温度测定

选取完整、健康的红花龙胆成熟叶片，用灭菌针头在红花龙胆叶片上进行微损伤处理，取直径2 mm菌块接种于微伤口处，并用无菌湿棉球包裹住叶柄保湿，后分别置于0、5、10、15、20、25、30、35、40℃和45℃的连续光照培养箱中培养，3 d后统计叶片发病情况，并用游标卡尺测量病斑直径（mm），以接种空白PDA为对照，重复3次。

1.7 数据分析

采用DPS 7.05软件对数据进行方差分析，以LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 红花龙胆枯萎病症状

病害初期，红花龙胆基部的茎秆和叶片边缘、叶尖上形成水渍状不规则坏死病斑，病健交界明显，茎秆顶端幼叶正常生长;后期随着病斑快速扩展，整株叶片和茎部干枯坏死，干燥时坏死部位呈棕褐色，干枯植株不倒伏（图1a，1b）。

2.2 病原菌分离与菌株的致病性

采用组织分离法从红花龙胆枯萎病典型病样的病健交界处分离得到2个菌株（菌株编号为SB0629011和SB062903），经损伤处理的红花龙胆叶片接种菌株SB0629011后3 d叶片上出现直径6.3～8.7 mm 的不规则水渍状坏死病斑，发病率为100%，与田间早期发病症状相似（图1c）;未经微损伤处理的叶片接种病原菌后，在接种部位形成4.5～5.6 mm不规则水渍状坏死病斑，发病率为72.22% （图1d），而在叶片的微损伤部位接种空白PDA则未表现出明显症状（图1e）。从发病叶片的病健交界处重新分离所得菌株形态特征与原菌株相同。说明病原菌对寄主地上部分的侵染能力极强，可从伤口和健康部位侵入红花龙胆使其发病。

2.3 红花龙胆枯萎病病原菌鉴定

2.3.1 病原菌的形态学鉴定

菌株在PDA中生长速度快，25℃培养3 d菌落直径（85.24±5.43） mm（n=3），菌落表面蓬松，白色棉絮状，正反面颜色一致，培养3周后菌落中央菌丝颜色逐渐加深为棕褐色（图2a～b）。菌株在含2.5 mmol/L乙酸的PDA培养基中生长缓慢，25℃培养6 d菌落直径（81.52±8.24） mm（n=3），培养20 d后菌丝体老化、塌陷，菌落底部形成扁平、深褐色或黑色的表面（图2c），在深色的下层基质表面形成不育子囊盘，杯状到盘状，棕色、肉桂色或浅黑色，大小为（3.15±1.21） mm×（2.05±0.73） mm（n=10）（图2d～e）。不育子囊盘由老化、深色的菌丝聚合而成（图2f）。基于形态学特征，初步将2株菌株鉴定为Clarireedia jacksonii［5］。

2.3.2 病原菌的分子生物学鉴定

2个菌株的ITS和Mcm7序列长度分别为584 bp和633 bp，相关序列已上传至GenBank并获得登录号（图3）。与GenBank中下载的18个菌株相关基因序列进行同源性比对，以Monilinia vacciniicorymbosi SSI1为外群菌株，用MEGA 11 构建的ML系统发育树。如图3所示，菌株SB0629011和SB062903与Clarireedia jacksonii以99%的高支持率聚为一支。因此基于形态学及ITS和Mcm7序列分析，将菌株SB0629011和SB062903鉴定为Clarireedia jacksonii。

2.4 温度和pH对红花龙胆枯萎病病原菌生长的影响

不同温度对红花龙胆枯萎病病原菌菌丝生长的

影响达到显著水平，该病原菌在5～35℃的温度范围内均可生长，0～25℃温度范围之间菌丝的生长速度随着温度的升高而加快，温度超过25℃后菌丝的生长速率减慢，25℃时菌丝生长速率显著高于其他温度处理（图4a）。病原菌对pH的适应范围较广，在pH 4～11均能生长，但在pH为5时生长速率显著高于其他pH条件。说明红花龙胆枯萎病病原菌最适生长温度为25℃，最适pH为 5（图4b）。

2.5 红花龙胆枯萎病病原菌的致死温度

红花龙胆枯萎病病原菌在不同温度下处理 10 min 后菌丝生长活性差异达到显著水平（图5）。随着处理温度的升高，菌絲生长活性随之显著降低。当处理温度达到50℃及以上时菌丝完全失活，说明病原菌致死温度为50℃处理10 min。

2.6 温度对病原菌侵染红花龙胆的影响

将病原菌接种到红花龙胆叶片上并在不同温度下培养3 d，如图6所示，15～35℃的温度范围内病原菌能够侵染红花龙胆，并且25℃的环境下病原菌侵染的速率最快，温度过高和过低都不利于病原菌的侵染。说明25℃为病原菌最佳侵染温度。

3 结论与讨论

植物真菌性枯萎病可由多种病原菌引起，其中镰孢属Fusarium致病菌最为常见，如尖孢镰F.oxysporum、层出镰孢F.proliferatum、厚垣镰孢F.chlamydosporum引起甘蓝、苦瓜、绿豆、豇豆、辣椒和茄子等的枯萎病［913］。轮枝孢属Verticillium部分真菌是很多茄科农作物枯萎病的病原菌［1415］。本研究基于形态学和ITS、Mcm7序列分析，将贵州红花龙胆枯萎病病原菌鉴定为 Clarireedia jacksonii，这是该菌引起龙胆科植物枯萎病的首次报道。

Clarireedia是SalgadoSalazar等在2018年从核盘菌属Sclerotinia中分出的独立类群，目前在分类系统中Clarireedia位于蜡盘菌科Rutstroemiaceae［5］。截至目前，已报道的Clarireedia真菌已有13个种（www.mycobank.org）。C.jacksonii是西伯利亚翦股颖Agrostis stolonifera、草地早熟禾Poa pratensis、紫羊茅 Festuca rubra、结缕草Zoysia japonica和狗牙根 Cynodon dactylon等草坪植物币斑病（dollar spot）的主要病原菌之一［1617］。

病原菌培养特性和侵染特性研究结果表明，C.jacksonii最适生长温度和侵染红花龙胆的温度一致，均为25℃，病原菌在适宜温度下快速增殖，为侵染奠定了良好的条件［18］;其最适pH为5，表明该菌喜欢酸性环境，与 Townsend等的研究结果一致，Townsend等认为将草坪草叶片表面pH调至中性至碱性环境可能是防治C.jacksonii所致币斑病的重要策略［19］。

本研究对红花龙胆枯萎病田间识别和防治提供了理论和实践参考。今后要开展红花龙胆枯萎病田间发病规律、病原菌田间越冬场所调查以及化学防控和土壤消毒技术的研究，以完善红花龙胆枯萎病的防治技术体系，实现红花龙胆绿色、优质、高效栽培。

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（责任编辑：杨明丽）