GW501516对低氧致肺动脉内皮细胞损伤的影响及机制 Δ

陈昌贵，易春峰，余志华，王 栋，李立为，贺立群 （武汉市第一医院心血管内科，武汉 430022）

低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是低氧所致的肺动脉高压，属于肺动脉高压的第三大类。持续的低氧可引起肺血管重构，进而导致HPH，长期过高的肺动脉压力会诱发患者出现难以控制的右心衰竭而死亡。肺动脉内皮细胞（pulmonary artery endothelial cells，PAECs）在低氧肺血管重构中起至关重要的作用，一旦PAECs 发生损伤，肺血管重构过程即同步启动，表现为血管收缩与舒张功能紊乱、肺动脉平滑肌细胞异常迁移与增殖、细胞外基质合成增加，最终导致肺动脉高压[1]。此外低氧还可诱导PAECs产生氧化应激，进而损伤PAECs，导致低氧肺血管重构和HPH[1]。因此，具有逆转低氧致PAECs 损伤作用的药物，可能会改善低氧肺血管重构。

过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）是一种核受体，在配体激活时充当转录因子促进细胞转录，包含PPARα、PPARγ和PPARδ 3种亚型。既往研究发现，PPARδ具有抑制炎症反应、抗氧化应激、改善内皮细胞功能、抗动脉粥样硬化等作用[2]。GW501516 是一种人工合成的PPARδ 激动剂，已被用于治疗肥胖症、脂质紊乱和心血管疾病。动物实验发现，每天以3 mg/kg GW501516 喂食低密度脂蛋白受体基因敲除小鼠，可减轻小鼠高脂饮食诱导的血管重构[3]；体外细胞实验发现，GW501516能够改善内皮细胞功能[4]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是参与氧化应激的主要分子之一，在血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞肥大模型中，GW501516可抑制血管平滑肌细胞内产生ROS[5]。由此推测GW501516可能通过抑制氧化应激，保护PAECs，从而在低氧肺血管重构中发挥保护作用。因此，本研究从GW501516 调控氧化应激的角度探讨了其对低氧致PAECs损伤的影响及机制，以期为GW501516用于临床治疗HPH提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究使用的主要仪器包括Dmil Led 型倒置荧光显微镜（德国Leica 公司）、3131 型和311 型细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）、Synergy HT型多功能酶标仪（美国Bio-Tek 公司）、NovoCyte 型流式细胞仪（美国ACEA Biosciences 公司）、ChemiDoc XRS 型化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 主要药品与试剂

GW501516（批号SML1491）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批号D2625）、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）（批号A0150000）均购自美国Sigma-Aldrich 公司，纯度均≥98%；核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）激活剂富马酸二甲酯（dimethyl fumarate，DMF）（批号S2586）、Nrf2 抑制剂ML385（批号S8790）均购自美国Selleck 生物科技有限公司，纯度均≥99%；CCK-8 试剂盒购自日本同仁化学研究所；Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（批号556547）购自美国BD 公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）（批号C0017）、ROS（批号S0033S）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（批号S0101S）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）（批号S0058）、过氧化氢酶（catalase，CAT）（批号S0051）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（批号S0131S）检测试剂盒、BCA 试剂盒（批号P0012S）、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（批号P0028）均购自上海碧云天生物技术有限公司；兔源PPARδ（批号74076）、Nrf2（批号12721）、血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）（批号43966）、裂解型胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3，C-caspase-3）（批号9661）、核纤层蛋白B1（Lamin B1）（批号13435）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（批号5174）等一抗均购自美国Cell Signaling Technology 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG二抗（批号ab6858）购自英国Abcam公司。

1.3 实验细胞

人PAECs 购自中国典型培养物保藏中心，批号为GPC0037。

2 方法

2.1 GW501516对PAECs的细胞毒性检测

2.1.1 实验分组与给药

将细胞分为对照组和GW501516 组，对照组给予0.1%DMSO 孵育12、24、48 h，GW501516 组给予100 nmol/L GW501516[6]孵育12、24、48 h。

2.1.2 PAECs相对存活率的检测

采用CCK-8 试剂盒检测细胞相对存活率，评估GW501516 的细胞毒性。细胞以5×103个/孔均匀接种于96孔板，每组设6个复孔。按“2.1.1”项下方法分组及给药后，按照试剂盒说明书加入CCK-8 溶液，同时设置空白组（培养基 100 μL+CCK-8 溶液 10 μL），继续孵育3 h 后于450 nm 波长处测定吸光度（OD）值。细胞的相对存活率＝（实验组OD－空白组OD）/（对照组OD－空白组OD）×100%。

2.2 低氧条件下PAECs 中PPARδ 蛋白表达水平的检测

2.2.1 实验分组与给药

将细胞分为对照组（常氧+0.1%DMSO）、低氧组（低氧+0.1%DMSO）、GW501516 干预组（低氧+100 nmol/L GW501516），低氧刺激时间为24 h。低氧刺激前1 h 用GW501516 孵育PAECs，当PAECs 融合度达到80%～90%时，1∶2 传代培养。各组细胞在低氧刺激前用不含胎牛血清的DMEM培养基培养12 h使细胞同步化。模拟低氧条件为含1%O2、5%CO2和94%N2的空气，模拟常氧为含5%CO2的空气（下同）。

2.2.2 PAECs中PPARδ蛋白表达水平的检测

采用Western blot 法检测PPARδ 蛋白的表达水平。细胞以1.5×105个/孔均匀接种于6 孔板，每组设3 个复孔。按“2.2.1”项下方法分组及给药后，使用细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白，通过BCA 试剂盒检测细胞总蛋白浓度。采用沸水浴灭活蛋白，上样前将各组细胞蛋白稀释成相同浓度，每个样本取15 μg总蛋白加样，并用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，再转移至聚偏氟乙烯膜中，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST 缓冲液洗膜，接着加入PPARδ、GAPDH 一抗（稀释比分别为1∶1 000、1∶5 000），4 °C 孵育过夜；洗膜后加入二抗（稀释比为1∶10 000），然后于室温下孵育1 h，TBST 缓冲液洗膜后，滴加ECL混合溶液，暗室中曝光，测定蛋白条带灰度值。以PPARδ 和GAPDH 条带灰度值的比值表示PPARδ蛋白的表达水平。

2.3 低氧条件下PAECs 的凋亡率、细胞活力、LDH 活性和ROS水平的检测

2.3.1 实验分组与给药

将细胞分为对照组（常氧+0.1%DMSO）、低氧组（低氧+0.1%DMSO）、NAC 干预组（阳性对照，低氧+10 mmol/L NAC[7]）、GW501516 干预组（低氧+100 nmol/L GW501516）。各药物干预组在低氧刺激前1 h给予不同药物孵育PAECs，低氧刺激时间为24 h。

2.3.2 细胞凋亡率的检测

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒联合流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞以1.5×105个/孔均匀接种于6 孔板，每组设3 个复孔。按“2.3.1”项下方法分组及给药后，以胰酶消化收集细胞，取约1×106个细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，依次加入PBS 200 μL、Annexin Ⅴ-FITC 10 μL 和PI 10 μL 重悬细胞，4 ℃避光孵育30 min后加入PBS 200 μL，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，使用NovoExpress软件分析数据。

2.3.3 细胞活力的检测

采用CCK-8 试剂盒检测细胞活力。细胞以5×103个/孔均匀接种于96孔板，每组设6个复孔。按“2.3.1”项下方法分组及给药后，按“2.1.2”项下方法操作，检测细胞存活率。

2.3.4 LDH活性的检测

使用LDH检测试剂盒检测细胞中LDH活性。细胞以5×103个/孔均匀接种于96孔板，每组设6个复孔。按“2.3.1”项下方法分组及给药后，每孔加入LDH 释放液10 μL，孵育1 h后以400×g 离心5 min，取上清液，按试剂盒说明书加入LDH 检测液后，于450 nm 波长处测定OD，检测LDH活性。

2.3.5 ROS水平的检测

采用二乙酰二氯氢化荧光素（DCFH-DA）探针联合荧光酶标仪测定细胞内ROS水平。细胞以3×104个/孔均匀接种于24孔板，每组设6个复孔。按“2.3.1”项下方法分组及给药后，吸出培养基，加入10 μmol/L无血清培养基稀释的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min后将培养基吸出，PBS 洗涤3 次后，置于荧光酶标仪（激发波长为488 nm，发射波长为525 nm）下检测细胞内ROS水平。

2.4 GW501516对低氧致PAECs损伤的作用机制研究

2.4.1 实验分组与给药

将细胞分为对照组（常氧+0.1%DMSO）、低氧组（低氧+0.1%DMSO）、DMF 干预组（阳性对照，低氧+75 μmol/L DMF[8]）、GW501516 干预组（低氧+100 nmol/L GW501516）、GW501516+ML385 干预组（低氧+100 nmol/L GW501516+5 μmol/L ML385[9]）。各药物干预组在低氧刺激前1 h 给予不同药物孵育PAECs，低氧刺激时间为24 h。

2.4.2 PAECs中HO-1蛋白和细胞核内Nrf2蛋白表达水平的检测

采用Western blot 法检测HO-1 蛋白和Nrf2 蛋白的表达水平。细胞以1.5×105个/孔均匀接种于6 孔板，每组设3 个复孔。按“2.4.1”项下方法分组及给药后，使用细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白，使用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒提取细胞核蛋白。按“2.2.2”项下方法检测HO-1蛋白和Nrf2蛋白的表达水平，HO-1、Nrf2、Lamin B1 和GAPDH 的稀释比例分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000，以HO-1蛋白与GAPDH蛋白的灰度值比值表示HO-1 蛋白的表达水平，以Nrf2 蛋白与Lamin B1 蛋白的灰度值比值表示Nrf2 蛋白的表达水平。

2.4.3 PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA、ROS 水平的检测

采用ELISA 法检测PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA水平；采用DCFH-DA探针联合荧光酶标仪测定细胞中ROS 水平。细胞以1.5×105个/孔均匀接种于6 孔板，每组设6个复孔。按“2.4.1”项下方法分组及给药后，按试剂盒说明书检测PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA水平；细胞中ROS水平的检测方法同“2.3.5”。

2.4.4 PAECs 的凋亡率、细胞活力、LDH 活性和Ccaspase-3蛋白表达水平的检测

按“2.4.1”项下方法分组及给药后，按“2.3.2”项下方法检测细胞凋亡率；按“2.1.2”项下方法检测细胞活力；按“2.3.4”项下方法检测LDH 活性；按“2.2.2”项下方法检测C-caspase-3 蛋白表达水平，其中C-caspase-3 一抗稀释比例为1∶1 000，以C-caspase-3与GAPDH条带灰度值的比值表示C-caspase-3蛋白的表达水平。

2.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 GW501516对PAECs的细胞毒性

GW501516 组PAECs 孵育12、24、48 h 后的细胞相对存活率[（98.37±2.14）%、（102.10±4.61）%、（103.24±3.66）%]与对照组PAECs孵育12、24、48 h后的细胞相对存活率[（100.00±2.68）%、（100.00±3.75）%、（100.00±4.23）%]比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 低氧条件下GW501516 对PAECs 中PPARδ 蛋白表达水平的影响

与对照组比较，低氧组PAECs中PPARδ蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与低氧组比较，GW501516 干预组PAECs 中PPARδ 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。结果见图1。

图1 低氧条件下GW501516 对PAECs 中PPARδ 蛋白表达的影响

3.3 低氧条件下GW501516 对PAECs 的凋亡率、细胞活力、LDH活性和ROS水平的影响

与对照组比较，低氧组PAECs的凋亡率、LDH活性、ROS 水平均显著升高（P＜0.05），细胞活力显著降低（P＜0.05）；与低氧组比较，NAC干预组和GW501516干预组细胞凋亡率、LDH活性、ROS水平均显著降低（P＜0.05），细胞活力均显著升高（P＜0.05）。结果见图2、表1。

表1 低氧条件下PAECs 的凋亡率、细胞活力、LDH 活性和ROS水平的检测结果（±s）

表1 低氧条件下PAECs 的凋亡率、细胞活力、LDH 活性和ROS水平的检测结果（±s）

a：与对照组比较，P＜0.05；b：与低氧组比较，P＜0.05。

组别对照组低氧组NAC干预组GW501516干预组ROS水平（n＝6）1.00±0.15 8.85±0.96a 2.14±0.38b 3.81±0.27b细胞凋亡率（n＝3）/%6.03±1.34 20.42±4.47a 13.55±2.06b 11.37±1.85b细胞活力（n＝6）/%100.00±5.67 70.91±5.23a 85.13±4.25b 88.86±5.92b LDH活性（n＝6）1.00±0.12 6.26±0.51a 3.32±0.23b 2.14±0.27b

图2 各组细胞的凋亡流式图

3.4 GW501516对低氧致PAECs损伤的作用机制

3.4.1 PAECs中HO-1蛋白和细胞核内Nrf2蛋白表达水平的检测结果

与对照组比较，低氧组PAECs 中HO-1 蛋白和细胞核内Nrf2 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）；与低氧组比较，DMF干预组和GW501516干预组PAECs中HO-1 蛋白和细胞核内Nrf2 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与GW501516 干预组比较，GW501516+ML385 干预组PAECs中HO-1蛋白和细胞核内Nrf2蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。结果见图3。

3.4.2 PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA、ROS 水平的检测结果

与对照组比较，低氧组PAECs中SOD、GPx、CAT水平均显著降低（P＜0.05），MDA、ROS 水平均显著升高（P＜0.05）；与低氧组比较，DMF干预组和GW501516干预组PAECs 中SOD、GPx、CAT 水平均显著升高（P＜0.05），MDA、ROS 水平均显著降低（P＜0.05）；与GW501516 干预组比较，GW501516+ML385 干预组PAECs 中SOD、GPx、CAT 水平均显著降低，MDA、ROS水平均显著升高（P＜0.05）。结果见表2。

表2 PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA、ROS 水平的检测结果（±s，n＝6）

表2 PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA、ROS 水平的检测结果（±s，n＝6）

a：与对照组比较，P＜0.05；b：与低氧组比较，P＜0.05；c：与GW501516干预组比较，P＜0.05。

组别对照组低氧组DMF干预组GW501516干预组GW501516+ML385干预组SOD 1.00±0.08 0.48±0.05a 0.95±0.06b 0.87±0.07b 0.34±0.03c GPx 1.00±0.15 0.15±0.01a 0.76±0.05b 0.58±0.07b 0.12±0.02c CAT 1.00±0.09 0.30±0.04a 0.75±0.05b 0.94±0.10b 0.25±0.03c MDA 1.00±0.08 7.56±0.81a 2.38±0.38b 3.66±0.26b 6.15±0.52c ROS 1.00±0.12 7.62±0.56a 2.53±0.15b 2.79±0.11b 5.81±0.47c

3.4.3 PAECs 的凋亡率、细胞活力、LDH 活性和Ccaspase-3蛋白表达水平的检测结果

与对照组比较，低氧组PAECs的凋亡率、C-caspase-3蛋白表达水平、LDH活性均显著升高，细胞活力显著降低（P＜0.05）；与低氧组比较，DMF干预组和GW501516干预组PAECs 的凋亡率、C-caspase-3 蛋白表达水平、LDH活性均显著降低，细胞活力均显著升高（P＜0.05）；与GW501516 干预组比较，GW501516+ML385 干预组PAECs 的凋亡率、C-caspase-3 蛋白表达水平、LDH 活性均显著升高，细胞活力显著降低（P＜0.05）。结果见图4、表3、图5。

表3 机制研究中PAECs 的凋亡率、细胞活力、LDH 活性的检测结果（±s）

表3 机制研究中PAECs 的凋亡率、细胞活力、LDH 活性的检测结果（±s）

a：与对照组比较，P＜0.05；b：与低氧组比较，P＜0.05；c：与GW501516干预组比较，P＜0.05。

LDH活性（n＝6）1.00±0.09 8.65±0.81a 4.67±0.35b 3.26±0.51b 8.05±0.78c组别对照组低氧组DMF干预组GW501516干预组GW501516+ML385干预组细胞凋亡率（n＝3）/%4.69±0.82 21.55±3.13a 12.94±2.06b 9.24±1.86b 22.92±3.54c细胞活力（n＝6）/%100.00±6.06 73.85±4.58a 87.11±6.23b 84.86±5.82b 73.04±4.24c

图4 机制研究中各组细胞的凋亡流式图

图5 GW501516 对低氧条件下PAECs 中C-caspase-3蛋白表达水平的影响

4 讨论

低氧能够诱导PAECs 损伤，使其凋亡增加，抑制PAECs 损伤和凋亡能够逆转HPH[1]。正常条件下LDH不能穿透细胞膜，但当细胞受损或死亡后，LDH 可以释放到细胞外，其释放水平能够反映细胞损伤程度[10]。caspase-3 是调控细胞凋亡的关键介质，可被外源性（死亡配体）和内源性（线粒体）凋亡途径激活，是最重要的胱天蛋白酶。caspase-3 激活后生成的C-caspase-3 是细胞凋亡的主要执行者之一，亦是细胞凋亡的标志蛋白[11]。研究发现，PPARδ合成型激动剂L-165041能够抑制H2O2诱导的人脐静脉血管内皮细胞损伤，抑制其凋亡，而PPARδ的沉默逆转了这种作用[2]。此外，PPARδ可通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路来抑制缺氧诱导的内皮祖细胞凋亡[12]。本研究发现，在低氧刺激下，PAECs 中PPARδ 蛋白表达水平降低，细胞凋亡率升高，C-caspase-3表达水平升高，细胞活力降低，LDH活性升高；而GW501516 可上调PPARδ 蛋白的表达，抑制低氧诱导的PAECs 损伤，且实验浓度的GW501516 对PAECs无明显细胞毒性。因此，本课题组推测低氧通过抑制PPARδ蛋白表达来损伤内皮细胞，GW501516则通过激活PPARδ来发挥保护内皮细胞的作用。

低氧能够诱导氧化应激，导致PAECs 的损伤和凋亡，抑制氧化应激可抑制PAECs 损伤及HPH 的形成[1,13―14]。有研究表明，PPARδ能够抑制高糖诱导的血管内皮功能障碍及ROS 的产生[15]。在动脉粥样硬化的动物模型中发现，PPARδ 可减少ROS 的产生，从而发挥保护内皮细胞的作用[16]。另有研究表明，GW501516 能够通过抑制ROS 产生而抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞肥大[5]。本研究发现，GW501516 及NAC 均可抑制低氧诱导的PAECs损伤及ROS产生。因此，本课题组推测GW501516 可通过抑制氧化应激来抑制低氧诱导的PAECs损伤。

Nrf2是一种参与氧化应激的关键转录因子，其在细胞核内可与抗氧化反应元件结合，来促进下游抗氧化酶或蛋白的表达，从而发挥抗氧化应激作用。CAT、GPx、HO-1 和SOD 是Nrf2 通路下游的主要抗氧化酶。其中，HO-1 可降解血红素，产生一氧化碳、亚铁和胆绿素，而HO-1以及血红素分解代谢产物均具有抗氧化作用，并能够缓解肺血管重构[17]；SOD可将超氧化自由基分解为H2O2，促进氧自由基的清除，上调SOD活性，减轻肺血管重构[18]；GPx可催化谷胱甘肽与H2O2或其他过氧化物的反应，生成氧化型谷胱甘肽和H2O，从而消除ROS[11]；CAT 能催化H2O2生成H2O 与O2。氧化应激能导致细胞脂质过氧化，MDA是脂质过氧化的产物，其水平与氧化应激呈负相关。Nrf2 激活剂能够通过上调肺动脉组织内SOD、HO-1 活性，降低MDA 及ROS 水平，抑制低氧诱导的氧化应激，从而缓解大鼠低氧肺血管重构[19]。在高糖诱导人脐静脉血管内皮细胞氧化应激的细胞模型中发现，PPARδ 激动剂GW0742 和L165041 可激活Nrf2，并以浓度依赖的方式上调人脐静脉血管内皮细胞内HO-1 蛋白和mRNA 的表达，抑制ROS 产生，从而发挥保护人脐静脉血管内皮细胞的作用[20]。在内皮细胞中，GW0742通过诱导SOD、CAT等抗氧化酶的表达，减少肿瘤坏死因子α诱导的内皮细胞产生ROS[2]。内皮细胞特异性PPARδ基因敲除小鼠主动脉内CAT 和GPx 的表达降低，氧化应激增强[21]。本研究发现，Nrf2 激活剂DMF 和GW501516 均可升高Nrf2 蛋白、HO-1 蛋白的表达水平及SOD、GPx、CAT 水平，降低MDA、ROS 水平，减轻低氧诱导的PAECs 损伤，且Nrf2 抑制剂ML385 能够逆转GW501516 的上述作用。这说明GW501516 可通过抑制氧化应激，减轻低氧诱导的PAECs 损伤，其机制可能与激活Nrf2有关。

综上所述，GW501516可通过激活Nrf2，抑制氧化应激来减轻低氧诱导的PAECs 损伤。本研究仅从细胞水平探讨了GW501516 对低氧诱导PAECs 损伤及氧化应激的影响，本课题组将在后续动物实验中观察GW501516 对低氧诱导的肺动脉高压大鼠内皮细胞功能、氧化应激及肺血管重构的影响。