不同品种抹茶营养物质和抗氧化活性的测定及主成分分析

邬刚,马云龙,徐铭辰

(潍坊工程职业学院 基础教学部,山东 潍坊,262500)

茶是最受欢迎的饮品之一,起源于我国的云贵高原,迄今已有几千年的种植历史,因其独特的口感、风味和保健功效在世界范围内被广泛消费[1-2]。抹茶是一种粉末茶,以茶树嫩叶为原料,经过遮阴栽培、蒸青、冷却、脱水、干燥、组合粉碎等多道工序制作而成[3-4]。抹茶能较好地保存茶叶中的营养物质和活性成分,使其具有较高的营养与保健价值[5-6]。此外,与传统茶叶不同,抹茶中的水溶性和水不溶性成分都可以摄入,增强其健康功能潜力,如抗氧化和抗疲劳运动训练恢复等[7]。这是由于抹茶茶粉表面积较大,更容易被人体吸收,且人体对抹茶营养的吸收率也能大大提高[1]。由于抹茶具有鲜甜的味道和良好的色泽,常被作为一种健康无害的天然食品添加剂,广泛用于食品工业[8-9]。

抹茶中富含茶氨酸、茶多酚和生物碱等天然活性物质,具有多种益于人体健康的功效。茶氨酸是一种广泛存在抹茶中比较特殊且含量最高的氨基酸,不易分解,极易溶于水,其水溶液呈弱酸性,具有焦糖的香味和类似味精的鲜爽味,可减轻咖啡因的苦味,是抹茶滋味鲜爽的主要来源[1,10]。茶多酚是抹茶中最重要的活性物质,约占抹茶质量的10%,包括花青素、黄酮类、酚酸类和儿茶素类等多酚类化合物[1]。茶多酚作为天然抗氧化剂,可有效延缓谷物贮藏期间的油脂氧化[11]。此外,儿茶素类化合物作为含量最高的多酚类化合物,是抹茶保健功效的主要成分,包括儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯等天然活性物质[1,12]。口服儿茶素类化合物可通过改善小鼠肠道微生物群落进而产生抗氧化、抗炎反应缓解结肠炎[13-14]。咖啡碱是抹茶中含量较高的一种生物碱,具有抗氧化和调节中枢神经系统的作用[8]。因此,抹茶具有较大的经济和健康价值。

近年来,抹茶产业发展迅速,呈上升趋势,从事抹茶加工的茶企数量也逐年增多,市场需求不断扩大[4,15]。但是,仍然缺乏对抹茶抗氧化活性的全面调查,以及对不同抹茶产品中生物活性成分的鉴定和定量。因此,本研究旨在系统评估不同品种抹茶在水分、水浸出物、可溶性蛋白、可溶性糖、茶氨酸、茶多酚、儿茶素类化合物、咖啡碱含量和体外抗氧化活性的差异,并结合主成分分析的方法综合分析差异,合理评价抹茶的营养价值和保健功效,以期为抹茶的研究与开发提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料:鸠坑、龙井43、茂绿、迎霜和中茶302等抹茶样品,采购于浙江茶叶集团有限公司,由我国茶树品种制成,均以新鲜茶树嫩叶为原料,采用蒸汽杀青、冷却、脱水、复合干燥、组合粉碎等多种工艺制备而成;青岚、若竹和五十铃等抹茶样品,采购于上海钜云食品原料商行,为日本茶树品种。所有抹茶样品运送至实验室后干燥密封待用。

试剂:乙醇、磷酸、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白、葡萄糖、福林酚、碳酸钠、氢氧化钠(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯(色谱纯),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除能力检测试剂盒,南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

DHG-9053A台式鼓风电热恒温干燥箱,上海习仁科学仪器有限公司;HZK-FA110电子分析天平,上海诺萱科学仪器有限公司;HL2020-A激光粒度分析仪,北京海鑫瑞科技有限公司;HSY-26电热恒温水浴锅,南京贝登医疗股份有限公司;UV1990A双光束紫外可见分光光度计,上海赫尔普国际贸易有限公司;1260高效液相色谱仪,美国安捷伦公司。

1.3 实验方法

1.3.1 基础理化指标测定

水分:参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》测定;水浸出物:参照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物测定》测定;粒度(D60):参照GB/T 34778—2017《抹茶》测定;灰分:参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》测定;可溶性糖:参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》测定;茶多酚:参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》测定;茶氨酸:参照GB/T 23193—2017《茶叶中茶氨酸的测定 高效液相色谱法》测定。

采用考马斯亮蓝法测定样品中可溶性蛋白含量,具体如下:取适量样品溶于水中,吸取1 mL上清液与4 mL考马斯亮蓝G-250(0.6 g/L)反应10 min后置于595 nm测定吸光值[16]。

1.3.2 儿茶素类化合物和咖啡碱测定

儿茶素类化合物:参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》测定;咖啡碱:参照GB/T 8312—2013《茶 咖啡碱测定》测定。

1.3.3 抗氧化活性测定

根据DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除能力检测试剂盒说明书分别检测样品的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除率,具体如下:取适量抹茶样品,按料液比1∶200(g∶mL)加水助溶,超声10 min后抽滤,吸取100 μL上清液,加入100 μL DPPH甲醇溶液(0.2 mmol/L)、ABTS甲醇溶液(吸光值为0.7)或羟自由基溶液(8.8 mmol/L过氧化氢溶液、9 mmol/L硫酸亚铁溶液和9 mmol/L水杨酸乙醇溶液等体积混合),混匀后置于黑暗条件下反应30 min,分别置于517、734 nm或510 nm处测定吸光值,分别以甲醇和过氧化氢作代替样品作为阳性对照,以去离子水代替样品作为空白对照[16-17]。以50 μg/mL的维生素C作为样本阳性对照。DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除率计算如公式(1)所示:

(1)

式中:A1、A2和A3分别为样品、对照和空白的吸光值。

参考WANG等[7]提供的方法综合评价样品的抗氧化活性如公式(2)所示:

(2)

抗氧化指数得分率为上述3种抗氧化活性检测方法的抗氧化指数得分的平均值。

1.4 数据处理

实验结果均以平均值±标准偏差(SD)的形式表示;采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析(ANOVA),P<0.05表示差异显著;使用GraphPad Prism 8.0进行绘图;为避免各个指标间的单位量纲差异,对所有指标数据进行标准化处理,再使用SPSS 21.0软件进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种抹茶基础理化指标的比较

8个不同品种抹茶的水分、水浸出物、粒度和灰分含量如表1所示,不同品种抹茶间的水分、水浸出物、粒度和灰分等指标存在一定差异(P<0.05)。8种抹茶的水分含量为3.44%～4.23%,符合GB/T 34778—2007《抹茶》中水分低于6%的要求。造成抹茶水分差异较大的原因可能是由于制作抹茶的茶树品种不同,不同品种对水分的结合能力也不同。此外,不同品种抹茶的灰分含量为7.08～7.75 g/100 g,也符合GB/T 34778—2007《抹茶》中灰分低于8%的要求。8种抹茶的水浸出物和粒度(D60)分别为33.57%～43.38%和14.19～15.54 μm,与WANG等[7]研究结果相一致,所有抹茶的粒度(D60)符合GB/T 34778—2007《抹茶》中粒度(D60)低于18 μm的要求。通常,水浸出物含量的高低可反映抹茶中可溶性物质的多少,标志着抹茶滋味、厚薄的浓郁程度,可进一步反映抹茶品质的优劣[18]。我国不同品种抹茶的水浸出物含量为38.31%～43.38%,平均值为40.37%,其中“龙井43”品种的水浸出物含量最高;而国外不同品种抹茶的水浸出物含量仅为33.57%～36.44%,平均值为35.18%,显著低于我国抹茶样品(P<0.05)。这一结果说明我国抹茶品质优于国外,这是由于我国的茶叶品质更好,茶树品种培育更优,尤其是以“龙井43”品种为原料制备的抹茶样品具有最高的水浸出物和最低的灰分。

表1 不同品种抹茶基础理化指标的比较Table 1 Comparison of basic physicochemical indicators in different varieties of matcha

2.2 不同品种抹茶营养物质的比较

8个不同品种抹茶的可溶性蛋白、可溶性糖、茶氨酸和茶多酚含量如图1所示。由图1-A可知,不同品种抹茶中可溶性蛋白含量存在显著差异(P<0.05),其含量为2.22～2.77 g/100 g,平均可溶性蛋白含量为2.47 g/100 g。我国不同品种抹茶的可溶性蛋白含量为2.45～2.77 g/100 g,平均值为2.55 g/100 g;而国外不同品种抹茶的可溶性蛋白含量仅为2.22～2.45 g/100 g,平均值为2.35 g/100 g,显著低于我国抹茶样品(P<0.05)。虽然抹茶中可溶性蛋白含量较低,但却与抹茶品质有关,对提高抹茶的营养价值及滋味品质有一定的促进作用[19]。此外,抹茶的蛋白质含量在一定程度上可反映所用茶叶原料的老嫩,通常茶叶越嫩,蛋白质含量越高[20]。可溶性糖是构成抹茶滋味和黏稠度的主要物质之一[3]。如图1-B所示,8个不同品种抹茶中可溶性糖含量为6.31～7.16 g/100 g,平均可溶性糖含量为6.65 g/100 g,与WANG等[7]研究结果相一致。我国不同品种抹茶的可溶性糖含量为6.49～7.16 g/100 g,平均值为6.75 g/100 g;而国外不同品种抹茶的可溶性糖含量仅为6.31～6.6 g/100 g,平均值为6.48 g/100 g,显著低于我国抹茶样品(P<0.05)。茶氨酸是氮素循环的主要代谢产物之一,与抹茶品质有着直接而重要的关系[21]。根据图1-C可知,不同品种抹茶中茶氨酸含量存在显著差异(P<0.05),其含量为1.46～2.09 g/100 g,平均茶氨酸含量为1.74 g/100 g,其中“龙井43”品种的茶氨酸含量最高。我国不同品种抹茶的茶氨酸含量为1.58～2.09 g/100 g,平均值为1.82 g/100 g;而国外不同品种抹茶的茶氨酸含量仅为1.46～1.78 g/100 g,平均值为1.62 g/100 g,显著低于我国抹茶样品(P<0.05)。当抹茶中茶氨酸含量较高时,其口感会表现出醇爽、回甘的特点,此外,茶氨酸还具有镇静安神、提高记忆力和免疫力、抗氧化及保肝护胃等保健功效[22]。茶多酚是衡量抹茶品质的重要指标之一,其含量高低不仅与抹茶的色泽息息相关,也与抹茶的保健价值脉脉相通[22]。如图1-D所示,不同品种抹茶中茶多酚含量差异显著(P<0.05),其含量为10.96～12.67 g/100 g,平均茶多酚含量为11.74 g/100 g,其中“龙井43”品种的茶多酚含量最高。我国不同品种抹茶的茶多酚含量为11.33～12.67 g/100 g,平均值为11.96 g/100 g;而国外不同品种抹茶的茶多酚含量仅为10.96～11.77 g/100 g,平均值为11.38 g/100 g,显著低于我国抹茶样品(P<0.05)。这一结果与WANG等[7]研究结果相一致。综上可知,我国抹茶产品的可溶性蛋白、可溶性糖、茶氨酸和茶多酚含量均高于国外抹茶产品,尤其是以“龙井43”品种为原料制备的抹茶产品。因此,我国的抹茶产品应筛选出类似“龙井43”的抹茶制作所需的茶树品种,有利于提高我国抹茶产业的品质。

A-可溶性蛋白;B-可溶性糖;C-茶氨酸;D-茶多酚图1 不同品种抹茶可溶性蛋白、可溶性糖、茶氨酸和茶多酚的比较Fig.1 Comparison of soluble protein, soluble sugar, theanine and tea polyphenols in different varieties of matcha注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。

2.3 不同品种抹茶儿茶素类化合物和咖啡碱的比较

儿茶素类化合物是抹茶中含量最多的一类多酚类化合物,约占多酚类化合物总量的70%,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗焦虑和改善认知功能障碍等多种生物活性[23]。在化学结构上以C6-C3-C6为基本碳架,是由2-苯基苯并吡喃构成的一系列衍生物。不同品种抹茶儿茶素类化合物组成和咖啡碱含量测定结果见表2。由表2可知,在不同品种抹茶中共检测出6种儿茶素类化合物,其中表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯是主要的儿茶素类化合物,这些物质之和约占整个儿茶素类化合物的95%。不同品种抹茶中各儿茶素类化合物含量差异显著(P<0.05)。表没食子儿茶素没食子酸酯是抹茶中含量最高的一种儿茶素类化合物,其含量为5.01～5.74 g/100 g,平均含量为5.39 g/100 g。而我国不同品种抹茶的没食子儿茶素没食子酸酯含量为5.31～5.74 g/100 g,平均值为5.54 g/100 g,显著高于国外抹茶样品(含量为5.01～5.26 g/100 g,平均值为5.13 g/100 g)(P<0.05)。有趣的是,“龙井43”抹茶样品具有最高的没食子儿茶素没食子酸酯含量,与图1-D的结果相一致。每日食用抹茶和富含没食子儿茶素没食子酸酯的食物可有效降低患结肠炎的风险,这与改善肠道微生物群落结构、维持肠道屏障、串扰宿主氧化和炎症反应有关[24-25]。抹茶中表没食子儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的含量分别为1.33～1.75 g/100 g和0.74～1.06 g/100 g,平均值分别为1.53 g/100 g和0.88 g/100 g。而我国不同品种抹茶的表没食子儿茶素和表儿茶素没食子酸酯含量分别为1.47～1.75 g/100 g和0.74～1.06 g/100 g,平均值分别为1.43 g/100 g和0.92 g/100 g,显著高于国外抹茶样品(含量分别为1.33～1.52 g/100 g和0.75～0.84 g/100 g,平均值分别为1.43 g/100 g和0.8 g/100 g)(P<0.05)。表没食子儿茶素和表儿茶素没食子酸酯能够中和自由基并提高酶的解毒活性,包括谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶[1]。此外,不同品种抹茶中咖啡碱含量存在显著差异(P<0.05),其含量为2.03～2.69 g/100 g,平均咖啡碱含量为2.41 g/100 g,其中“茂绿”品种的咖啡碱含量最高。我国不同品种抹茶的咖啡碱含量为2.03～2.69 g/100 g,平均值为2.42 g/100 g;而国外不同品种抹茶的咖啡碱含量仅为2.35～2.43 g/100 g,平均值为2.4 g/100 g,与我国抹茶样品无显著差异(P>0.05)。通常,儿茶素类化合物具有苦涩的特性,咖啡碱的加入有利于中和涩味,而抹茶滋味的好坏很大程度上取决于咖啡碱、茶氨酸和茶多酚的含量与比例关系[26]。

2.4 不同品种抹茶抗氧化活性的比较

抹茶中富含茶氨酸、茶多酚和咖啡碱等天然生物活性物质,具有较强的体外抗氧化活性[23,27]。本研究采用DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除率等3种体外抗氧化活性测定方法来比较不同品种抹茶的抗氧化活性,结果见图2。由图2-A可知,不同品种抹茶的DPPH自由基清除率差异显著(P<0.05),为25.28%～26.87%,平均DPPH自由基清除率为26.08%,其中“龙井43”品种抹茶的DPPH自由基清除率最高。我国不同品种抹茶的DPPH自由基清除率为25.94%～26.87%,平均值为26.39%;而国外不同品种抹茶的DPPH自由基清除率仅为25.28～25.85 g/100 g,平均值为25.56%,显著低于我国抹茶样品(P<0.05)。如图2-B所示,“中茶302”和“龙井43”品种抹茶具有最高的ABTS阳离子自由基清除率,分别可达20.06%和19.98%,二者无显著差异(P>0.05)。我国不同品种抹茶的ABTS阳离子自由基清除率为19.22%～20.06%,平均值为19.73%,显著高于国外抹茶样品(ABTS阳离子自由基清除率为18.23%～19.18%,平均值为18.72%)(P<0.05)。由图2-C可知,“若竹”品种抹茶具有最低的羟自由基清除率,仅为35.18%,除“青岚”品种抹茶样品与其无显著差异(P>0.05)外,与其他品种抹茶样品均差异显著(P<0.05),而“迎霜”品种抹茶具有最高的羟自由基清除率,高达36.35%。国外不同抹茶的羟自由清除率仅为35.18%～35.67%,平均值为35.39%,显著低于我国抹茶样品(羟自由基清除率为35.58%～36.35%,平均值为35.98%)(P<0.05)。所有抹茶样品的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除率均显著高于维生素C对照组(P<0.05)。此外,通过抗氧化指数得分率综合评价各品种抹茶的体外抗氧化活性。如图2-D所示,“龙井43”品种抹茶具有最高的抗氧化指数得分率,高达99.61%;其次分别为“中茶302”品种(99%)和“茂绿”品种(98.48%)。“若竹”品种抹茶的抗氧化指数得分率最低,仅为94.07%。原因可能是不同品种抹茶的茶氨酸、茶多酚、儿茶素类化合物和咖啡碱等天然生物活性物质的含量差异导致体外抗氧化活性差异较大[28-29]。

A-DPPH自由基清除率;B-ABTS阳离子自由基清除率;C-羟自由基清除率;D-抗氧化指数得分率图2 不同品种抹茶抗氧化活性的比较Fig.2 Comparison of antioxidant activity in different varieties of matcha

2.5 不同品种抹茶的主成分分析

主成分分析是通过降维的方法将多个变量转为少数几个综合变量的多元统计分析方法,可将众多信息中相互重叠的信息去除[30]。而基于营养物和抗氧化活性对不同品种抹茶进行综合评价时,不能仅参考一个或几个指标特征的优劣,更应该全面、客观、系统地将所有指标都纳入综合评价范畴[30]。由于不同指标存在单位和量纲地差异,故应将这些指标进行标准化处理,再进行主成分分析,结果见图3和表3。

由图3可知,前2个主成分(principal component, PC)的累积方差贡献率可达82.5%。8个不同品种抹茶可明显被分为3组,分别为“中茶302”和“龙井43”,3个国外品种及剩余的4个品种抹茶。随后,构建各主成分的线性模型,得到的线性模型如下:

PC1=2.24Z2-0.04Z1+1.61Z3-1.82Z4+2.07Z5+2.12Z6+2.39Z7+2.47Z8+0.78Z9+2.23Z10+1.86Z11-0.18Z12+2.19Z13+2.41Z14+1.94Z15+2.56Z16+2.46Z17+1.79Z18+2.55Z19

PC2=2.5Z1-0.56Z2+0.61Z3+1.68Z4+1.47Z5-1.51Z6-0.72Z7-0.75Z8+2.33Z9+1.09Z10+0.69Z11+2.54Z12-0.43Z13+0.78Z14+0.76Z15-0.51Z16-0.39Z17+1.34Z18-0.18Z19

图3 不同品种抹茶的主成分分析评分Fig.3 Principal component analysis score in different varieties of matcha

表3 主成分特征向量、特征值、方差贡献率及累计方差贡献率Table 3 Principal component eigenvectors, eigenvalues, variance contribution rate, and cumulative variance contribution rate

由表3可知,PC1的特征值为9.51,方差贡献率为58.12%,是贡献最大的主成分,主要综合了抹茶的水浸出物、可溶性糖、茶多酚、茶氨酸、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、DPPH自由基清除率、ABTS阳离子自由基清除率和抗氧化指数得分率,代表主要综合反映抹茶营养物质和体外抗氧化活性。PC2的特征值为3.99,方差贡献率为24.38%,主要综合了水分、没食子酸、咖啡碱和羟自由基清除率,是对PC1营养物质和体外抗氧化活性的补充。

以各主成分的方差贡献率占累计总方差贡献率的比率为权重计算综合得分[30],计算如公式(3)所示:

(3)

根据表4可知,在综合反映抹茶品质的PC1中,排名前3的抹茶依次为“龙井43”、“中茶302”和“茂绿”,说明这3种抹茶的可溶性糖、茶氨酸、茶多酚和表没食子儿茶素含量较高。其中“龙井43”品种抹茶的PC1综合指标值为0.35,高于其他7种抹茶,故“龙井43”品质抹茶的营养物质更丰富。在PC2综合指标值中排名前2的抹茶分别为“中茶302”和“龙井43”,其综合指标值分别为0.12和0.1,说明“中茶302”和“龙井43”的体外抗氧化活性比其他6种抹茶更强。与其他7种抹茶相比,“龙井43”品质抹茶的PC1和PC2值均较高,因此“龙井43”品质抹茶的茶氨酸和茶多酚等2种生物活性物质含量相对最高,综合体外抗氧化指数得分率最高,营养物质含量也更丰富。

表4 不同品种抹茶品质评价的综合指标值、综合得分和排名Table 4 Comprehensive index value, comprehensive score, and ranking of the quality evaluation in different varieties of matcha

3 结论

抹茶是一种未经发酵的茶粉,其富含茶氨酸、茶多酚和咖啡碱等多种天然生物活性成分,常被作为一种健康无害的天然食品添加剂,在食品工业有巨大的经济和应用价值。同时,在运动训练和体能恢复中适量摄入会取得积极效果。本研究以8种不同品种的抹茶为研究对象,系统地比较不同品种抹茶在相关基础理化指标(水分、水浸出物、粒度和灰分)、营养物质(可溶性蛋白、可溶性糖、茶氨酸、茶多酚、儿茶素类化合物和咖啡碱)和体外抗氧化活性的品质差异。结果表明,抹茶中水分、粒度(D60)和灰分等基础理化指标均符合GB/T 34778—2017《抹茶》的要求,且我国不同品种抹茶的平均水浸出物含量显著高于国外抹茶样品(P<0.05)。抹茶中可溶性蛋白(2.22～2.77 g/100 g)、可溶性糖(6.31～7.16 g/100 g)、茶氨酸(1.46～2.09 g/100 g)、茶多酚(10.96～12.67 g/100 g)等营养物质在不同品种中存在显著差异(P<0.05)。表没食子儿茶素没食子酸酯是抹茶中含量最高的单体儿茶素类化合物,约占整体儿茶素类化合物含量的65%。此外,不同品种抹茶的体外抗氧化活性差异显著(P<0.05),其中“龙井43”品种抹茶的综合体外抗氧化活性最强。基于主成分分析,构建了主成分向量及其方差贡献率的综合指标评价模型,发现“龙井43”品种抹茶的综合得分最高,说明其品质最优。本研究可为抹茶的研究与开发提供数据基础。