怀山药连作地土壤元素的变化和连作障碍解决方法研究

2024-02-02王帆林王代军成宏斌潘晓翠

安徽农业科学 2024年2期

王帆林王代军成宏斌潘晓翠

摘要測定和分析温县怀山药栽培基地土壤元素随连作年限的变化，分离鉴定怀山药根际土中化感物质的种类和含量，探究引起怀山药连作障碍的主要因素，并考察施用杀线菌肥对山药产量和品质的影响。结果表明：怀山药连作1～4年土壤元素和有机质含量先增多后减少，以连作2年最高，连作使土壤氮、磷、钾比例失调，Cu、Cd、Cr、Ni、Pb在土壤表层富集，土壤pH减小。随着生长期的延长，土壤中全磷、重金属、Na含量降低，全钾、Ca增多，Mg和有机质变化不明显；应用GC-MS和HPLC在山药根际土中共鉴定出11种化感物质。施用杀线菌肥可有效缓解山药连作障碍，达到增产提质防病害的功效，以3 000 kg/hm效果最优，比对照增产26.83%，根长增加35.26%，畸形率降低82.43%；3 000、6 000和9 000 kg/hm施肥量使山药增粗10.00%～15.00%，根际线虫分别比对照减少了82.80%、73.12%和52.69%。

关键词怀山药；连作障碍；土壤元素；杀线菌肥

中图分类号 S344.4 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）02-0161-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.036

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Change of Soil Elements and the Solution of Continuous Cropping Obstacle in Chinese Yam Continuous Cropping Land

WANG Fan-lin，WANG Dai-jun，CHENG Hong-bin et al

（Hainan Academy of Agricultural Reclamation Science Group Co.， Ltd.，Sanya，Hainan 572024）

Abstract The study measured and analyzed the changes of soil elements with continuous cropping years in the Chinese yam cultivation base in Wen County， isolated and identified the types and contents of allelochemicals in the rhizosphere soil of Chinese yam， explored the main factors causing obstacles to continuous cropping of Chinese yam， and investigated the effect of nematicidal bacterial fertilizer on the yield and quality of Chinese yam.The results showed that the contents of soil elements and organic matter increased first and then decreased in 1-4 years of Huai yam continuous cropping， the second year was the highest. The proportion of nitrogen， phosphorus and potassium in soil was imbalanced， Cu， Cd， Cr， Ni and Pb were enriched at the upper soil layer， but soil pH decreased. With the extension of growth period， the contents of total phosphorus， heavy metals and Na in soil decreased， total potassium and calcium increased， and the changes of Mg and organic matter were not obvious. A total of 11 allelochemicals were identified in the rhizosphere soil of yam by GC-MS and HPLC.The application of nematicidal bacterial fertilizer could effectively alleviate the obstacles of continuous cropping of yams， achieve the effect of increasing yield， improving quality and preventing diseases. The effect of 3 000 kg/hm was the best， which increased yield by 26.83% compared to the control， increased root length by 35.26%， and reduced deformity rate by 82.43%.The fertilization amounts of 3 000， 6 000 and 9 000 kg/hm increased the thickness of yam by 10.00%-15.00%， and reduced the number of nematodes in the rhizosphere by 82.80%， 73.12% and 52.69%， respectively， compared to the control.

Key words Chinese yam;Continuous cropping obstacle;Soil elements;Nematicidal bacterial fertilizer

作者简介王帆林（1990—），女，甘肃白银人，农艺师，硕士，从事天然产物开发与利用研究。*通信作者，研究员，博士，博士生导师，从事天然药物学研究。

收稿日期 2023-02-14

连作障碍是指植物在经过连作后，在正常栽培管理条件下也会出现生育状况变差、病虫害加重、产量降低、品质变劣的现象，也称“重茬问题”。由于耕地有限，药用植物栽培面临严峻的连作障碍问题，我国有230多种药用植物需大面积栽培，其中根茎类占比70%以上。山药（Dioscorea opposita Thunb.）连作使山药生长抑制、病虫害严重，甚至绝收。怀山药是古怀庆府（今河南省焦作市境内）所产的山药，属我国有名的道地药材，怀山药的轮作周期为5年，该区域也是道地怀地黄产区，怀山药和怀地黄严重的连作障碍和市场需求的不断增大使怀药不得不在道地产区之外的区域种植，严重影响了其药用价值，我国道地怀山药的生产面临巨大难题。

引起山药连作障碍的原因有3个方面：①土壤环境改变，包括土壤养分失衡和微生物群落破坏；②植物自毒作用，山药自身次生代谢产物的囤积对山药生长形成抑制，主要是指化感物质；③病虫害残留，连年种植导致山药土传病害加剧。上述因素联动互作，使山药严重减产，并极大降低山药品质，其中以植物自毒作用在近年来研究较多，且尚无较好的解决办法。目前发现，引起植物自毒作用的化感物质几乎都是植物的次生代谢产物，可划分为14类，其中酚酸类物质通过对植物膜系统、内源激素、土壤微生物等作用导致植物生长受到抑制，且种类多、较活跃，是目前化感作用研究的重点，如对羟基苯甲酸、咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、五倍子酸、香草酸、苯甲酸等，怀山药根系酚酸类化合物随生长周期而变化。但是，目前学者对连作障碍机理研究较多，但仍缺乏行之有效的解决办法，主要通过加强田间管理进行缓解。该研究测定和分析温县怀山药栽培基地土壤元素随连作年限的变化，分离鉴定怀山药根际土中化感物质的种类和含量，探究引起怀山药连作障碍的主要因素，并考察施用杀线菌肥对山药产量和品质的影响，以期为缓解怀山药连作障碍提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器 LC 2000液相色谱仪，配有T2100P色谱工作站，上海天美科学仪器有限公司；气相色谱质谱仪，美国PerkinElmer公司；原子吸收光谱仪，美国PerkinElmer公司；ME2002E电子分析天平、ME204E精密电子分析天平，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；KE52AA旋转蒸发器、SHI－Ⅲ型循环水真空泵、低温冷却液循环泵，上海亚荣生化仪器厂；GOKU－A1超纯水系统，锐思捷水纯化技术有限公司。

1.2 试剂阿魏酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸、香草酸和丁香酸标准品，純度≥98%，上海源叶生物科技有限公司；微生物菌肥由河南保和堂提供；杀线复合酶制剂由海南省农垦科学院集团有限公司生物工程中心配制；甲醇、甲酸、乙腈，色谱级，赛默飞世尔科技有限公司；工业乙醇（≥95%），白沙南大洋实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤采样和元素测定。选择在地理位置上连片且均有不同连作年限地块的4块栽培基地，采用五点取样法，分别在6月和10月采集土壤，检测在山药快速生长期和山药收获期土壤磷、氮、钾、钙、镁、钠、重金属、有机质和土壤pH。各地块栽培管理模式一致。

土壤元素测定方法按照相关检测标准进行，其中土壤全氮含量的测定依据HJ 717—2014，采用凯氏法；土壤全磷含量的测定依据GB 9837—1988；土壤全量钙、镁、钠、钾元素含量的测定依据NY/T 296—1995，采用氢氟酸-高氯酸消解法；土壤有机质含量的测定依据MY/T 1121.6—2006；土壤重金属含量的测定依据NY/T 1613.14—2008，采用王水回流消解原子吸收法；土壤酸碱度的测定依据NY/T 1121.2—2017。

1.3.2 根际土提取物制备。山药挖出后用纯水冲洗根上附着的泥土，将收集的泥浆用滤纸过滤后得到山药根际土，将根际土放入烧杯中，加入10倍体积75%乙醇，超声提取30 min后用滤纸过滤，并收集滤液，重复提取2次后，将收集到的滤液合并，40 ℃下于真空旋转蒸发仪浓缩至3～5 mL，用氨水调节酸碱度至pH≥9。称取适量柱层析硅胶（200～300目）进行装柱，依次用3 mL甲醇和3 mL 1%氨水淋洗硅胶柱后，将提取液凝缩液进行上样，用3 mL甲醇（色谱级）洗脱柱子，再用3 mL 5%乙酸甲醇溶液洗脱，此时收集洗脱液，并常温挥干溶剂，向洗脱液中加入2 mL甲醇硫酸溶液（4∶1），50 ℃恒温水浴30 min后，依次加入5 mL 20 g/L无水硫酸钠溶液和5 mL正己烷（色谱级），振荡萃取10 min后，10 000 r/min条件下离心3 min，取上层备用。

1.3.3 液相色谱条件。色谱柱为Agligen ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长280 nm；柱温25 ℃；流动相A为0.1%乙酸溶液，B为甲醇溶液。梯度洗脱：0～35 min，85%～55%A；35～70 min，55%～10%A；70～75 min，10%～0%A；75～80 min，0～55%A；80～85 min，55%～85%A；85～90 min，85%A。流速1 mL/min。

1.3.4 质谱条件。GC-MS分离柱（PE，Elite-5MS，30 m×0.25 mm，0.25 μm），进样口温度250 ℃，载气为氦气，流速1.2 mL/min，分流比10∶1；扫描范围m/z 50～500，延迟时间2.5 min，检测时间2.6～29.0 min。升温程序：0～2 min，0～50 ℃；2～4 min，50 ℃；4～9 min，50～200 ℃；9～19 min，200～220 ℃；19～27 min，220～260 ℃；27～29 min，260 ℃。

1.3.5 杀线菌肥对山药生长的影响试验。杀线菌肥由微生物肥料和复合酶杀线虫剂以150∶1质量比混合而成，试验地为河南省温县保和堂四大怀药规范种植基地山药连作地块。设置杀线菌肥用量分别为3 000、6 000和9 000 kg/hm，小区面积5 m，每小区一半施用杀线菌肥，一半为对照，小区间保护行宽度1 m，每处理4次重复。杀线菌肥经农用车抛洒到对应区组后，旋耕机翻地两遍，其他农事操作与基地内规范化山药种植保持一致。

山药收获期，在各小区采用五点取样法划定5个采样点，在采样点内采集0～20 cm土层土壤，并采挖山药；对新鲜采挖到的山藥进行根粗、长度、鲜重测量。采用波尔曼漏斗分离法对所采土壤中的线虫进行分离，显微镜下观察线虫生活状态并记录活线虫数。

1.4 数据统计分析所有试验数据采用Excel 2013软件进行分析统计。

2 结果与分析

2.1 土壤元素检测从表1可以看出，连作1～4年，随着年限的增加，土壤全量氮磷元素含量先增多后减少，最终低于连作1年，钾元素含量变化不明显；相同连作年限，在10月，土壤中全磷含量低于6月，全氮含量与作物生长期无相关性，全钾含量则有增大现象，说明山药地土壤中钾元素随着作物生长周期逐渐富集。路翠红等研究表明，氮、磷、钾施肥比例为1.00∶0.81∶2.00时，怀山药产量和商品性最好；许念芳等研究也表明，山药氮、磷、钾施肥量当量比为1.00∶0.94∶1.58时，山药经济产量最高。此次试验中，连作1～4年山药地土壤氮、磷、钾元素比例分别为1∶1.7∶31.1、1∶1.3∶27.2、1∶1.7∶36.3和1∶1.7∶33.4，与山药高产优质栽培所需三大元素的适宜比例相差较大，怀山药栽培基地存在元素失衡现象，以钾元素含量过高为主要表现。由此推测，山药连作和不合理的施肥习惯加重了山药地养分失调，是引起山药连作减产的原因之一。此外，对照《全国土壤养分含量分级标准表》对试验地土壤肥力等级进行划分，发现该试验区山药地土壤肥力水平处于极低水平。该试验区为四大怀药道地产区，由于耕地面积有限，栽培以四大怀药常年轮作为主要模式，简单的轮作模式不利于土壤修复，因而应当注重土壤肥力监控并及时调整施肥方案。

从表2可以看出，0～50 cm土层中，相同连作年限，在10月，随着土层深度的增加，Cu、Cd、Cr、Ni、Pb含量总体逐渐降低，表现为重金属在土壤表层的累积，而在6月，以Cr随土层深度增加而明显增多；50～90 cm土层中，随着山药生长周期的延长，同一土层重金属含量均明显降低，6和10月土壤中5种元素含量与土层深度变化相关性不明显。以上说明山药根系对土壤中5种元素均有一定的富集作用，而浅层土壤由于田间施肥、翻耕等使土壤混合较为均匀，根系对元素富集作用不能很好地体现出来。成芬等研究表明，怀山药对土壤中不同重金属元素的富集能力表现为Cu＞Zn＞Mn＞Ni＞Cr＞Pb；该试验检测结果表明怀山药对Cu元素吸收力较强，对其余元素吸收能力较弱，这与成芬等的研究结果相一致。

对不同连作年限0～90 cm土壤元素进行整体检测，结果发现（表3），随着山药连作年限的增大，Cu、Cd、Cr、Ni、Pb含量总体先增多后减少，以连作2年累积最多，但各元素含量水平变化与作物生长期和连作年限的相关性不明显。此外，根据检测数据，参照《农用地土壤环境质量标准》（GB 15618—2010），可以判断该试验采样区Cu、Cd、Cr、Ni、Pb含量符合国家一级土壤质量标准，试验地不存在Cu和Ni这2种微量元素缺乏及Cd、Cr、Pb这3种重金属超标现象，因此该试验中重金属污染不是怀山药连作减产的影响因素。

从表4可以看出，试验地土壤中Ca、Mg、Na含量处于较低水平，其中以Na含量最高，其次是Ca和Mg。连作1～4年，土壤Ca、Mg、Na在土壤中的含量随着连作年限的增加变化不明显，推测此现象与山药本身对3种元素吸收利用量较小且栽培基地所有田块施肥方式均一有关。此外，相同连作年限，随着山药生长期的延长，土壤中Ca、Mg元素含量变化不明显，但Na含量明显降低。

从表5可以看出，土壤有机质含量随连作年限的增加呈先增多后减少的趋势，在连作2年时达到最大值，在6月和10月分别为7.75和7.55 g/kg。推测其原因为在连作2年时，随着山药营养体在土壤中遗落的增加，土壤中有机质含量升高，此后，由于山药连作障碍加剧，土壤理化环境改变，导致土壤有机质减少。

此外，连作1～4年土壤pH逐渐减小，以连作2年减幅最大，但总体在7.4～8.6，且收获期小于快速生长期。相同生长期，0～90 cm深度的土壤pH随土层深度的增加无明显变化。研究表明，随着山药的生长代谢，山药根系分泌物和营养体凋落腐烂释放出的酸性物质对土壤环境影响较大，根系分泌的酚酸类物质是导致怀山药连作障碍的因素之一。该研究中，山药连作年限越长，土壤酸性越强，与前人的研究结果相符。对于土壤酸度随土层深度的变化，还需控制好田间管理和采样方法，以获得更精确的数据。

2.2 根际土代谢物的分离鉴定

采用GC-MS检测方法，在山药根际土提取物中鉴定出7种物质，分别是肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、硬脂酸、α-桉叶醇和蒿本内酯，检测以油酸作为标准物质，各组分在山药根际土中的相对含量分别为0.892、3.817、2.222、2.456、0.579、1.357、0.347 mg/kg。采用HPLC方法，以标准物质为对照，发现在山药根际土中还存在对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸和对香豆酸4种常见化感物质，其相对含量分别为0.321、0.363、0.214和0.291 mg/kg，但未检测到阿魏酸组分，为验证山药根际土提取物中是否含有阿魏酸成分，将上述4种化合物同阿魏酸标准品混合溶于甲醇后，同样方法进行甲酯化，经正己烷萃取后，进行GC-MS分析，结果检测到与进样量相同含量的阿魏酸甲酯，由此断定甲酯化过程对阿魏酸结构无破坏作用，因而可确定该试验提取得到的土壤次生代谢物中不含阿魏酸。

2.3 杀线菌肥对山药生长的影响

从表6可以看出，杀线菌肥对提高山药产量、品质和防治山药根际线虫方面具有明显作用。在产量和品质方面，以杀线菌肥施用量为3 000 kg/hm时山药产量和品质最好，相比对照，增产26.83%，山药长度增加35.26%，畸形率降低82.43%。施用3 000 kg/hm杀线菌肥比施用6 000和9 000 kg/hm产量分别高出5.25%和8.79%，山药长度增加了7.44%和16.63%。此外，施用杀线菌肥对山药根系膨大具有促进作用，使山药根粗比对照增大10.00%～15.00%，但膨大作用不随施肥量的增加而变化。

在防治山药根际线虫方面，相比对照，施用杀线菌肥3 000、6 000和9 000 kg/hm山药根土中线虫分别比对照减少了82.80%、73.12%和52.69%，表明杀线菌肥对山药根际线虫具有一定防治效果。

由此可见，杀线菌肥的施用可有效防治山药根际线虫，缓解山药地连作障碍，提高山药产量和品质。此外山药地施用杀线菌肥以3 000 kg/hm效果明显优于6 000和9 000 kg/hm施用量，表明山药栽培过程中要合理用药施肥，避免过量施用导致的高投入产出比和农田生态问题。

3 结论与讨论

连作可导致土壤元素发生变化，是怀山药连作障碍的原因之一。连作1～4年山药地各元素和有机质含量先增多后减少，以连作2年最高。连作使土壤三大元素比例失调加重，Cu、Cd、Cr、Ni、Pb这5种重金属在土壤表层富集，土壤pH也逐渐减小，全磷、重金属、Na随山药生长期而降低，全钾、Ca增多，Mg变化不明显，长期单一的作物栽培種类和施肥习惯使怀山药栽培基地肥力水平较低，怀山药栽培需根据土壤养分变化调整施肥方案。该试验在怀山药根际土中共鉴定出肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸等11种物质，经文献研究其均属于化感物质。施用杀线菌肥可明显改善山药产量和品质，以3 000 kg/hm施用效果最优，比对照增产26.83%，山药长度增加35.26%，山药畸形率降低82.43%，施肥使山药增粗15.00%，3 000、6 000和9 000 kg/hm施肥量土壤中根际线虫分别比对照减少了82.80%、73.12%和52.69%，因此施用杀线有机肥可明显提高山药产量和品质，防治山药线虫，有效缓解山药连作障碍。

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