基于外周神经-免疫交互探讨针刺对抗炎性疼痛的作用

时方圆,李亚男,贾 若,杨 霖,曹娇娇,陈志翰,曾佳明,窦保敏,郭 义,3,林小伟,3△

(1.天津中医药大学,天津 301617;2.天津中医药大学实验针灸学研究中心,天津 301617;3.天津市现代中医理论创新转化重点实验室,天津 301617)

针刺作为一种补充和替代疗法,在世界各个国家得到广泛的应用,且在临床实践中已被证明对缓解疼痛具有实质性的改善作用。炎症性疼痛疾病在针刺治疗疼痛患者中占41%[1],而神经系统和免疫系统的相互作用对炎症性疼痛的产生和敏化至关重要。炎症性反应是造成炎性疼痛的直接因素,但以往对针刺减轻炎性疼痛的机制研究多集中在镇痛物质的作用方面。近年来研究表明,外周及中枢水平神经和免疫系统间的相互作用在针刺抑制炎性痛中发挥着重要作用,而外周炎症局部和DRG是针刺信号启动和抑制疼痛信号上行传导的重要部分。本研究在炎症局部和DRG水平的神经免疫相互作用角度总结了针刺治疗炎症性疼痛的外周机制,以期为针刺治疗炎症性疼痛的应用和研究提供依据。

当组织发生损伤时,相关免疫细胞被激活并募集到损伤局部,释放各种促炎细胞因子、趋化因子和神经递质等,增加局部血流量及组织液的渗透,进而引起局部炎症反应。同时,免疫细胞释放的炎症介质还可激活伤害性感受器神经元,将有害刺激转换为神经冲动,通过外周传入纤维经背根神经节传入中枢神经系统。被激活的伤害性感受器神经元末梢会释放大量的神经肽,如P物质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)等加重局部炎性反应[2],并且导致伤害性感觉神经元过度兴奋,即外周敏化。炎性痛在外周水平的机制主要是免疫细胞介导的炎症反应与伤害性感受器痛觉敏化之间的相互作用,形成外周神经-免疫互作网络。针刺可通过调节外周神经-免疫间的相互作用,从而改善炎性痛。

1 针刺对炎症局部神经免疫相互作用的调节

研究发现,针刺通过调节炎症局部如单核巨噬细胞、T淋巴细胞等多种免疫细胞及信号转导通路来抑制炎症介质的释放,促进阿片肽、大麻素和腺苷类等镇痛物质及其受体的活性,从而控制炎症级联反应及疼痛的神经传入,减轻炎性痛。

1.1 针刺可抑制免疫细胞释放免疫介质

1.1.1 巨噬细胞 巨噬细胞是极具异质性及可塑性的免疫细胞,能够响应不同微环境信号而极化为对组织稳态或宿主防御具有特定功能的表型。当组织损伤后,单核巨噬细胞极化为促炎性M1型巨噬细胞,释放促炎细胞因子,参与损伤初时的炎症反应。炎症后期具有抗炎性的M2型巨噬细胞表达增加,促进损伤组织的修复重塑及内环境稳态的保持。M1型/M2型巨噬细胞的平衡在炎症调节中具有重要作用。

在类风湿性关节炎疼痛大鼠模型中,手针“足三里穴”可升高M2/M1巨噬细胞比例,降低IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-7和IL-18促炎因子,升高IL-4、IL-5抑炎因子来缓解炎性痛[3]。Silva等[4]在炎性痛模型中同样证明了手针“三阴交穴”能够通过减少腓肠肌肌肉中M1型巨噬细胞、增加M2型巨噬细胞来诱导肌肉巨噬细胞表型转换。NOD样受体家族3(NOD-like receptors,NLRP3)炎性小体是巨噬细胞中介导炎症激活的蛋白胞质复合物,能够活化IL-1β和IL-18来介导炎性反应和疼痛[5]。研究发现,在骨关节炎(OA)豚鼠模型中NLRP3炎症小体的激活可产生IL-1β、TNF-α,促进滑膜炎症、软骨细胞凋亡和软骨退变,电针“内膝眼穴、犊鼻穴”能够显著抑制NLRP3炎性体的活化以及基质金属蛋白酶13(MMP-13)、半胱天冬酶-1(Caspase-1)与IL-1β蛋白的表达,进而降低豚鼠的机械性痛觉超敏,改善关节软骨结构,减少软骨表面纤维性颤动,缓解其骨关节疼痛[6-7]。

1.1.2 趋化因子 趋化因子是免疫系统重要的调节介质,为一类具有募集细胞功能的小分子蛋白。同时,这类小分子蛋白还可通过共同的受体和配体促进免疫系统与神经系统之间的相互交流、相互作用,共同维护机体的内稳态。

单核细胞趋化蛋白1(MCP1)/趋化因子受体2(CCR2)轴在膝骨关节炎(KOA)中起着重要作用,其在炎性早期可募集单核细胞和巨噬细胞,分泌炎症因子和神经生长因子(NGFs),进而加重OA进展[8]。Li等在膝骨关节炎(KOA)模型研究中发现[9],手针“犊鼻穴、足三里穴”可降低软骨和滑膜组织中MCP1的表达,抑制MCP1/CCR2轴上巨噬细胞的募集,下调IL-1β、TNF-α和NGFs,能够明显减轻膝关节的痛觉过敏和软骨退行性变,减少OA膝关节的神经芽生。趋化因子CXCL10能够趋化含阿片类物质的单核细胞/巨噬细胞迁移至炎症部位。Wang等[10]发现电针“环跳穴”可使CFA大鼠炎症部位趋化因子CXCL10表达上调,含阿片类物质的CXCR3+(CXCL10的受体)巨噬细胞增加。有趣的是,重复注射CXCL10可模拟针刺上调含阿片肽的巨噬细胞缓解炎性痛,而在中和CXCL10后电针诱导的抗过敏作用和表达阿片类肽的CXCR3+巨噬细胞的数量降低了。

此外,α7烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)是一种由胆碱能神经末梢释放的乙酰胆碱激活的受体,被认为是抑制巨噬细胞释放的促炎细胞因子的关键靶点。Yang等在小鼠术后肠梗阻(POI)模型的研究中还发现[11],电针“足三里穴”能够通过迷走神经背核兴奋迷走神经,激活巨噬细胞上α7nAChR介导的JAK2/STAT3信号通路来抑制IL-6和TNF-α炎症因子的表达,降低胃肠局部的免疫反应,进而促进术后肠麻痹小鼠胃肠动力的恢复。表明针刺可以通过驱动迷走神经兴奋性来抑制M1型巨噬细胞释放炎性因子,并促进M2型巨噬细胞释放抑炎性因子以此调节巨噬细胞极化来缓解炎症及疼痛。

1.1.3 T细胞 T细胞是机体调节免疫反应的重要细胞,可分化成辅助性T细胞1(Th1)、辅助性T细胞2(Th2)、辅助性T细胞17(Th17)和调节性T细胞(Treg)等具有不同效应的细胞亚群,相应细胞亚群通过产生特定的促炎或抗炎细胞因子调节免疫反应,并且作用于痛觉神经元产生疼痛。例如,T细胞通过释放白介素-17A(IL-17A)和干扰素-γ(IFN-γ)兴奋神经末梢,使痛觉受体敏感,进而介导疼痛信号的传导。Th1细胞可释放IL-1、IL-2、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和INF-γ等促炎因子,Th2细胞可产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等抑炎因子。Th1/Th2平衡对维持机体正常的免疫功能具有重要作用。同样,T细胞中抗炎型Tregs和促炎型Th17的平衡对于控制炎症反应的发生发展也具有重要作用。

Th1/Th2细胞在类风湿性关节炎患者以及动物模型体内具有明显的比例失衡现象。Xu等[12]发现针刺“足三里穴”能减轻完全弗氏佐剂(CFA)诱导的关节炎大鼠关节部位的炎症和疼痛,修复RA的损伤。同时,通过构建细胞-细胞通讯网络发现Th1/Th2细胞是CFA大鼠关键适应性免疫细胞,也是MA调控的主要靶细胞。Wang等[13]认为调节Th1/Th2平衡是电针抗炎作用的关键,针刺“足三里穴”治疗能够降低CFA小鼠炎症足底中Th1细胞产生的IL-2和IFN-γ,升高Th2细胞产生的IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子,来抑制相关的炎症反应,诱导组织重塑。这些研究表明：Th1/Th2之间的平衡介导了针刺抗炎镇痛效应。Yu等人在CFA小鼠模型中发现,电针“足三里穴、三阴交穴”可促进Treg细胞的活化,进而释放抗炎因子IL-10、IL-4、IL-13和TGF-β;同时也通过减少外周免疫器官脾脏中巨噬细胞和中性粒细胞数量,降低IL-1β、NLRP3和TNF-α促炎介质的表达来抑制炎症[14],减轻疼痛。在溃疡性结肠炎(UC)模型的研究中[15],电针“关元穴、足三里穴”可以增加Treg细胞的数量以及TGF-β、IL-10和IL-2的表达,降低Th17细胞的数量和IL-6、IL-17A和IL-17F的水平,表明电针能够通过调节Th17/Treg细胞平衡来修复受损的结肠黏膜,改善结肠炎症带来的疼痛。VIP是一种神经内分泌肽,能够调节抗炎和促炎介质的产生发挥抗炎作用。Zhu等[16]在胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的研究中证实,电针“悬钟穴、足三里穴”显著诱导了Treg细胞扩张,同时激活血管活性肠肽(VIP)信号来抑制Th17分化。这同样说明,针刺可以通过调节Treg细胞与Th17细胞之间的平衡抑制促炎因子、促进抑炎因子的表达来抑制炎症。

综上,针刺能够通过调控相关趋化因子,如抑制趋化因子MCP1/CCR2轴、升高趋化因子CXCL10以及由胆碱能神经末梢释放的α7nAChR驱动迷走神经兴奋性来调节巨噬细胞M1/M2;同时针刺还可以通过调节T细胞中Th1/Th2、Th17/Treg的平衡,抑制促炎因子的释放,促进抗炎因子的产生进而发挥其抗炎镇痛作用。但是,针刺调控T细胞的平衡并非是迷走神经介导的抗炎通路,其上游机制有待进一步研究。

1.2 针刺可促进免疫细胞释放镇痛物质

1.2.1 阿片肽 内源性阿片肽对神经、感觉、运动与免疫具有重要调节作用,阿片类药物是治疗慢性疼痛的主要药物,但其产生的不良反应,如镇静、恶心、呕吐、便秘和呼吸抑制等限制了其效用,特别是在慢性疼痛患者通常需要的较高剂量情况下。

阿片肽在介导外周针刺镇痛中尤为突出。β-内啡肽(β-END),是人体内源性吗啡样物质,与脑啡肽、强啡肽共同组成阿片肽物质,该物质作用于μ和δ阿片受体抑制外周炎性疼痛。在CFA诱导的炎性痛大鼠模型中[10],电针“环跳穴”可促使炎症部位含阿片类物质的巨噬细胞增加,也能够促进炎症部位β-END及外周μ和δ阿片受体的释放,然而在给予β-内啡肽(β-END)和脑啡肽的拮抗剂后,电针的长期镇痛效应则被抵消,但DYN(强啡肽)拮抗剂并没有影响针刺镇痛效应[17]。同样,在急性痛风关节炎大鼠模型的研究中[18],发现用2/100 Hz电针“足三里穴、昆仑穴”也可显著上调局部踝关节皮肤组织中β-END的表达,激活外周感觉神经元上的μ和κ阿片受体,发挥外周镇痛作用。Taguchi等[19]研究发现,电针“足三里穴”在外周炎症过程中能够激活外周神经末梢上的μ、δ和κ受体,进而降低周围神经元兴奋性,抑制如SP等促炎神经肽的释放发挥镇痛作用。表明针刺可以促使含有阿片肽的免疫细胞迁移到炎症组织[19],并释放β-END和ENK作用于外周感觉神经元上μ、δ和κ受体,发挥镇痛作用。

1.2.2 大麻素 内源性大麻素系统是参与疼痛传递的重要神经调节系统,主要包括大麻素受体1(CB1)和大麻素受体2(CB2)两种G蛋白耦联受体。CB1主要分布于中枢神经系统,CB2主要存在于外周角质细胞和免疫细胞中。

研究发现,在CFA诱导的炎性痛大鼠模型中[20-21],电针“环跳穴、阳陵泉穴”既可以增强大鼠炎症足爪和炎症皮肤组织角质形成细胞、巨噬细胞与T淋巴细胞等免疫细胞中的CB2受体表达,也能够减轻疼痛。并且,在CFA模型、KOA、神经炎性疼痛模型中,电针还能够通过激活CB2受体,抑制TNF-α、IL-1β和IL-6促炎因子的释放[22-25],从而抑制外周炎性疼痛。Gao等[26]于研究电针“环跳穴、阳陵泉穴”可以降低皮肤巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化、炎症组织中IL-1β水平发挥抗炎镇痛作用的基础上,发现在CB2受体被敲除后,电针对NLRP3炎性体的激活减少并且镇痛作用明显减弱。此外,针刺介导的大麻素与β-END、阿片肽系统在镇痛中皆具有协同作用。以上研究表明,针刺能够通过激活CB2受体以及增强其表达,减少NLRP3炎性小体以及TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子的产生,进而抑制痛觉感受器敏化,缓解疼痛。

1.2.3 腺苷 腺苷是一种重要神经活性物质,可调节免疫细胞释放炎症介质参与免疫调节。腺苷有4种受体：腺苷1受体(A1R)、腺苷2a受体(A2aR)、腺苷2b受体(A2bR)和腺苷3受体(A3R),主要通过A1R和A2aR受体抑制炎性疼痛。Li等[27]在炎症性肠病(IBD)的研究表明,电针“大肠俞穴”能够通过增加小鼠结肠组织中A1、A2a和A3受体水平的表达,降低A2b受体的表达,来抑制IL-1β炎症因子的释放,进而抑制内脏痛。在胶原性关节炎(CIA)小鼠模型中[28],电针“足三里穴、三阴交穴”可以提高踝关节处腺苷A2受体的增加,抑制TNF-α促炎因子的释放,进而发挥抗炎和组织保护作用。故针刺能够通过调节腺苷受体的表达,抑制炎症因子的释放来发挥抗炎镇痛的作用。此外,腺苷、单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)和三磷酸腺苷(ATP)都被归为嘌呤物质,ATP被去磷酸酶依次剥离磷酸基团成为AMP,在外泌-5′-核苷酸酶(5′-NT)的作用下,AMP中磷酸基团的损失造成腺苷的形成,腺苷在腺苷脱氨酶的作用下脱氨成为肌酐[29-30],最终由肾脏代谢并通过尿液排泄。最近的研究表明,5′-NT是产生腺苷的关键酶,在促进腺苷生产时,电针能够通过上调5′-NT表达促进脊髓腺苷增加对神经性疼痛大鼠产生镇痛作用[31-32]。

2 针刺对DRG神经免疫相互作用的调节

炎症组织局部分泌的如TNF-α和IL-1β等炎性介质能够激活靶器官神经末梢伤害感受器,疼痛信号经DRG向中枢传递。在DRG,初级感受神经元上的瞬时受体电位香草-1(TRPV1)伤害性离子通道开启,能够激活初级感受神经元并释放P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)等活性物质,由于长期反复刺激致其过度兴奋,使得神经源性反应增强。

2.1 TRPV1

TRPV1是一种非特异性阳离子通道,存在于躯体感觉系统中,尤其是破坏性或潜在破坏性伤害感受器有反应的原代传入神经元。在炎性疼痛中,一般被认为与炎症和感知热性疼痛相关,并且在疼痛的发展和维持中发挥重要作用。

研究发现针刺可通过下调促炎神经肽SP、CGRP、VIP、促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和神经生长因子NGF的释放,进而降低TRPV1的表达及敏感性。在CFA诱导的慢性炎症性疼痛模型中[33],炎性反应使DRG中TRPV1和下游分子p-PKA、p-细胞外信号调节激酶(ERK)、p-c-Jun-N-末端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表达水平增加,以及相关转录因子、p-cAMP反应元件结合蛋白(CREB)、p-NFκB和有害离子通道Nav1.7的活化。然而电针“足三里穴”可通过降低DRG神经元中机械敏感性离子通道蛋白的活性,抑制外周DRG神经元的过度兴奋和TRPV1/NFκB信号通路的转导[34-36],而改善慢性炎症性疼痛。在急性炎性疼痛信号通路中TRPV1是MAS相关的G蛋白偶联受体C(MrgprC)激活的主要下游靶点,Liu等[37]在CFA诱导的小鼠研究中发现,电针“足三里穴、昆仑穴”可通过下调MrgprC,抑制PKC对TRPV1的磷酸化,使TRPV1通道敏感性及开放性减少,在外周发挥对炎性疼痛的治疗作用。此外,TRPV4与渗透压和机械敏感性高度相关,酸敏感离子通道3(ASIC3)可感受酸性环境及机械刺激,炎症可诱导其转录并产生转录后调节,影响神经元兴奋性,参与痛觉感受的敏感化过程。而小胶质细胞活化和增殖是许多中枢神经系统疾病的标志[38],包括神经性疼痛,小胶质细胞-TRPV4通道位于脊髓神经免疫轴的中心,将周围神经损伤转化为中枢致敏和神经性疼痛,故TRPV4是治疗慢性疼痛的潜在新靶点。Chen团队等[39-40]在叉菜胶或CFA诱导的小鼠研究中发现,电针“足三里穴”能够抑制DRG神经元中ASIC3和TRPV4的表达,同时也可以减轻角叉菜胶、CFA引起的炎症疼痛。

2.2 P物质(SP)

SP是一种源自感觉神经末梢的神经肽递质,为神经源性炎症的主要介质。SP与Receptor neurokinin-1(NK-1R)的结合可增加促炎细胞因子的分泌[41],进而促进炎症性疼痛。Zhang等也同样证实,电针“足三里穴”可降低CFA大鼠背根神经节中SP和NK-1R的水平,减少DRG中TNF-α、IL-1β及IL-6转录蛋白的表达而发挥镇痛作用。此外,当切断背神经根或注射SP受体拮抗剂后,电针对SP、NK-1R及其下游炎症因子的抑制作用消失[42],电针对CFA大鼠的镇痛作用也显著降低。这表明电针能够通过抑制DRG中SP的表达来阻止疼痛信号向中枢传导进而参与抗炎镇痛作用。

2.3 嘌呤能受体

嘌呤能受体分为P1(腺苷)和P2(腺嘌呤核苷酸)受体两大类。P2X受体广泛存在于与伤害性信息传递相关的外周和中枢神经细胞中。其中,P2X3、P2X4及P2X7受体是配体门控型非选择性阳离子通道,在初级感觉神经元上高度选择性表达,是参与炎症引起的痛觉敏感的重要通道。

炎症发生时受损组织或炎症细胞释放的三磷酸腺苷(ATP)与DRG中的P2X3结合,从而激活伤害性感受器传导疼痛信号。研究证明[43],电针可明显减少L4～6背根神经节P2X3阳性神经元,降低L6背根神经节P2X3蛋白表达,而P2X3激动剂能够降低电针对CFA大鼠的镇痛水平,尤其是在短期和长期100 Hz时[44]。在肠易激综合征(IBS)内脏疼痛和骨癌疼痛的大鼠研究中[45-46],电针可下调结肠肌间神经丛和DRG中P2X3受体的表达,减轻癌痛及内脏痛的敏感性。此外,在糖尿病诱发的神经痛大鼠研究中发现[47],电针能够通过下调DRG中P2X4和P2X7的表达,减轻或预防糖尿病神经痛的发生发展。

2.4 酪氨酸羟化酶TH

TH是儿茶酚胺多巴胺,去甲肾上腺素和肾上腺素合成中的限速酶,为外周交感神经系统的关键成分,在炎症性痛觉过敏的产生和维持中发挥重要作用。在三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎大鼠研究中,酪氨酸羟化酶免疫反应(TH-IR)纤维向背根神经节感觉神经元的萌发能够维持外周炎症疼痛,并使得炎症疼痛的进一步加重。电针“足三里穴、上巨虚穴”通过抑制L6DRG中TH的表达来减轻远端结肠的痛觉过敏和炎症损伤[48],这可能是电针缓解结肠炎症状的机制之一。

综上,针刺治疗炎性疼痛的外周机制可能是通过调节靶器官相关免疫细胞及其产生的细胞因子、免疫源性的神经肽介导局部炎性症状的改善,减少炎性介质对神经末梢伤害性感受器刺激抑制敏化,阻止疼痛信号向上传导。同时针刺还能进一步抑制背根神经节神经元的兴奋性及SP、CGRP等相关神经肽的产生,减少其对外周靶器官的轴突反射,阻止疼痛信号进一步向中枢传导,更好地发挥针刺抗炎镇痛作用。

3 小结

在基础研究及临床应用中,针灸改善炎性疼痛的有效性被充分证实,以往的针刺抗炎性痛的机制研究多集中在针灸调控镇痛物质的表达上。根据本研究所述,针灸能够通过调节神经-免疫间的互作网络,缓解炎症及疼痛。本研究将现有针刺调节炎性痛的外周神经免疫交互机制研究总结成以下4点：①针刺通过兴奋迷走神经平衡促炎/抑炎免疫细胞,调节免疫因子释放;②针刺通过趋化因子募集含神经递质的免疫细胞,释放镇痛性神经递质;③针刺通过抑制背根神经节初级伤害性神经元释放炎症介质,减轻外周敏化及疼痛传导;④针刺通过抑制伤害性感觉神经元离子通道活性,抑制神经源性炎症反应。总而言之,在外周水平,针灸通过调节炎症局部免疫细胞释放的炎症介质和镇痛物质,抑制外周靶器官伤害性感受器和伤害性感受神经元的激活,减轻炎症反应;也能够通过抑制背根神经节初级伤害性神经元离子通道活性,减少炎症介质的释放,抑制神经源性炎症反应,缓解外周敏化及疼痛信号向中枢传导。

针灸对外周神经-免疫交互的抗炎镇痛作用机制的研究是深入充分的,但也有不足之处。首先,在外周局部区域,尚不清楚哪些因素会影响免疫细胞和细胞内的分子信号转导以及镇痛物质及其受体的活性,从而减轻炎性痛。其次,P2X受体家族在神经性疼痛中均起重要作用,在DRG水平,P2X受体家族中其他受体是否也介导了针灸治疗炎症性疼痛的作用机制有待进一步探究。最后,目前针灸对炎症性疼痛研究的动物模型均是短暂性或急性疼痛型,对于针灸对慢性炎症性疼痛的有效性研究还需要与之相适用的模型。

针刺疗法在抗炎镇痛中的作用机制是复杂的,阐明针刺抗炎镇痛的科学机理,推进针灸事业的发展,特别是在针灸治疗炎症性疼痛作用机制的基础上进一步应用针灸和药物的组合治疗,管理和控制炎症和疼痛方面,仍有很多未知需要研究人员继续深入探究。