胃镜活检组织SF3B4及miR-96表达在胃癌病情及预后评估中的临床价值

董杰,杨松,肖俊,李鹏程

基因水平的标志物检测在胃癌病情及预后评估中更具有临床价值,其敏感度及特异度高于传统的肿瘤标志物(CEA、CA199等)、影像学及病理组织学TNM分期,但需要多个标志物联合检测以提高特异度及敏感度[1-2]。剪接因子3b亚基4(splicing factor 3b subunit 4,SF3B4)具有调控前体mRNA剪接及3’端加工等功能,在卵巢癌等多种恶性肿瘤中表达上调且与恶性程度、淋巴结转移及远处转移相关[3-4]。微小RNA-96(miR-96)可靶向多个基因调控肿瘤细胞恶性生物学行为及上皮间质转化[5-6]。研究发现miR-96可促进胃癌细胞增殖及侵袭,为潜在的胃癌病情及预后评估标志物[7]。目前SF3B4、miR-96在胃癌病情及预后评估中的临床价值尚未明确。本研究旨在检测胃镜活检组织SF3B4及miR-96表达并研究其临床价值,为胃癌临床诊疗策略制定提供基因水平证据,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1—12月洪湖市人民医院和华中科技大学同济医学院附属协和医院诊治的胃癌患者95例为研究对象(胃癌组)。另以同期胃良性疾病(包括胃良性溃疡、慢性胃炎、胃息肉等)患者60例为非胃癌组。2组患者在性别、年龄、美国东部肿瘤协作组(ECOG)评分(总分0～5分,评分越高表示一般状况越差)、体表面积、幽门螺杆菌(HP)感染方面比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性,见表1。本研究经医院医学伦理委员会审核及批准(YXLL-073),患者或家属知情同意并签署知情同意书。

表1 非胃癌组及胃癌组患者临床病理资料比较Tab.1 Comparison of clinical and pathological data between non gastric cancer group and gastric cancer group patients

1.2 病例选择标准 (1)入选标准:①经增强CT、普通胃镜、超声胃镜和/或术后病理组织学检查确诊;②首次确诊,既往无胃癌病史且未行相关治疗;③临床资料完整,有明确的临床TNM(cTNM)分期。(2)排除标准:①合并其他良恶性肿瘤、严重心肺血管病及其他胃良恶性肿瘤等;②胃继发性肿瘤、胃癌复发等;③合并精神神经疾病;④随访脱访者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 组织SF3B4、miR-96表达检测:胃癌组患者行胃镜活检取肿瘤组织及癌旁组织,非胃癌组患者取病变组织。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测胃癌组肿瘤组织、癌旁组织、非胃癌组病变组织SF3B4及miR-96表达。SF3B4上游引物序列5’-GGATGAGAAGGTTAGTGAACCGC-3’,下游引物序列5’-GGCATAGTCAGCATCTTCCTCAC-3’,miR-96上游引物序列5’-CTCGAGTCCTTGAAGGTCATCTTGGGCT-3’,下游引物序列5’-GCGGCCGCAGGCAGTGTAAGGCGATCT-3’。引物由上海生工公司合成纯化。RT-qPCR检测试剂购自大连Takara公司(产品名称Titanium One-Step RT-PCR Kit,批号639503),PCR仪器为美国安捷伦公司(仪器型号为Mx3000),反应体系25 μl,反应条件为:52℃孵育20 min,94℃预变性1 min;58℃退火1 min,64℃延伸扩增40 s,共计32个循环,最后一轮72℃反应8 min。SF3B4选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参,miR-96选择U6为内参,采用2-△△ct计算SF3B4及miR-96相对表达量。

1.3.2 患者预后及随访调查:胃癌组患者每3个月电话或门诊随访1次,随访时间至2023年5月,随访内容包括血常规、肝肾功能、影像学检查。统计患者预后状况(随访终点时死亡或存活、总生存期),其中随访1年时出现死亡、肿瘤复发、肿瘤进展、严重并发症(肠梗阻、恶病质、胃严重出血)等定义为1年预后不良。

2 结 果

2.1 组织SF3B4、miR-96表达比较 胃癌组肿瘤组织SF3B4、miR-96表达均高于癌旁组织及非胃癌组病灶组织,差异有统计学意义(P<0.01)。胃癌组癌旁组织与非胃癌组病灶组织SF3B4、miR-96表达的差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 胃癌组和非胃癌组患者SF3B4、miR-96表达比较Tab.2 Comparison of SF3B4 and miR-96 expression between gastric cancer group and non gastric cancer group patients

2.2 组织SF3B4、miR-96表达在不同临床资料中的比较 胃癌组肿瘤组织SF3B4、miR-96表达在性别、年龄、HP感染、肿瘤部位、CEA、CA199、病理类型方面比较差异无统计学意义(P>0.05), 而在肿瘤低分化、肿瘤最大直径≥5 cm、T3-4、有淋巴结转移及cTNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者SF3B4及miR-96表达显著高于肿瘤中-高分化、肿瘤最大直径<5 cm、T1-2、无淋巴结转移及cTNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者(P均<0.01),见表3。

表3 不同临床病理资料中胃癌组肿瘤组织SF3B4、miR-96表达比较Tab.3 Comparison of SF3B4 and miR-96 expression in tumor tissues of gastric cancer in different clinical and pathological data

2.3 组织SF3B4、miR-96表达预测胃癌1年预后不良的价值分析 绘制SF3B4、miR-96表达预测胃癌1年预后不良价值的ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示:SF3B4、miR-96及二者联合预测胃癌1年预后不良的AUC分别为0.785、0.779、0.952,二者联合优于单独预测效能(Z/P=3.451/0.017、3.565/0.014),见表4。

表4 SF3B4、miR-96预测胃癌1年预后不良的价值分析Tab.4 Value analysis of SF3B4 and miR-96 in predicting 1-year poor prognosis of gastric cancer

2.4 胃癌患者1年预后不良的死亡危险多因素Logistic回归分析 以胃癌患者1年预后不良死亡(赋值:存活=0,死亡=1)为因变量,以SF3B4、miR-96、肿瘤分化程度、肿瘤最大直径、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、cTNM分期为自变量进行多因素Logistic回归分析,结果显示:SF3B4≥1.51(赋值:<1.51=0,≥1.51=1)、miR-96≥1.28(赋值:<1.28=0,≥1.28=1)、肿瘤分化程度低(赋值:中-高分化=0,低分化=1)、肿瘤最大直径≥5 cm(赋值:<5 cm=0,≥5 cm=1)、肿瘤浸润深度T3-4(赋值:T1-2=0,T3-4=1)、有淋巴结转移(赋值:无=0,有=1)、cTNM分期Ⅲ～Ⅳ期(赋值:Ⅰ～Ⅱ期=0,Ⅲ～Ⅳ期=1)为胃癌死亡的独立危险因素(P<0.01),见表5。

表5 胃癌患者1年预后不良的死亡危险多因素Logistic回归分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of mortality risk for gastric cancer patients with poor 1-year prognosis

2.5 SF3B4、miR-96表达与胃癌生存期关系 胃癌患者95例随访至终点时存活36例,死亡59例。SF3B4≥1.51且miR-96≥1.28胃癌患者中位生存期(23.7±5.4)个月低于SF3B4<1.51或miR-96<1.28患者(31.2±6.5)个月(Log-rank=11.457,P<0.001)。

3 讨 论

mRNA前体的剪接及成熟对基因转录后表达具有决定作用,SF3B4为U2小核糖核蛋白复合物的核心组成部分,其功能异常可导致基因表达异常而导致恶性肿瘤发生、发展及转归[8]。SF3B4基因与SF3B145结合后可调控U2 snRNP与前体mRNA分支位点的结合,参与基因转录、翻译及信号转导等生理过程[9]。研究发现SF3B4对肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移具有调控作用,在多种恶性肿瘤中可检测到SF3B4表达异常,为潜在的病情及预后评估标志物[10-11]。研究发现SF3B4基因与胃癌的发病机制相关,多种基因通过调控SF3B4基因诱导的自噬信号通路参与胃癌的发生、发展及转归[12-13]。Yang等[14]研究发现SF3B4 通过促进 KLF 16 mRNA 从细胞核输出到细胞质来促进 Twist1 表达和透明细胞肾细胞癌进展。Ge等[15]研究发现GPAA1通过与RNA结合蛋白SF3B4结合促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移。研究发现SF3B4可通过调控凋亡信号通路、自噬等通路参与肝细胞癌的发生发展[16]。本研究发现胃癌患者胃镜活检肿瘤组织SF3B4显著高于癌旁组织及胃良性疾病患者病灶组织,证实SF3B4与胃癌发病机制密切相关。

胃癌的发病机制包括miRNA及相关基因表达异常,miRNA为内源性非编码单链RNA,主要是通过降解mRNA或抑制蛋白质翻译来调控转录后基因表达,在细胞增殖、凋亡、上皮间质转化等多种生物学过程中发挥重要作用[17]。越来越多的研究证实胃癌中存在多个miRNA表达异常,与恶性程度、病情严重程度及预后密切相关,在胃癌病情及预后评估中具有重要价值[18-19]。miR-96具有调控糖脂代谢等功能,同时通过多种机制调控细胞增殖、迁移及侵袭,在多种恶性肿瘤发病机制、病情及预后评估中具有重要价值[20-21]。刘丽丹等[22]检测胃癌组织miR-96表达,发现miR-96在胃癌中显著升高,且与淋巴结转移、浸润程度、TNM分期、分化程度相关。文俏程等[23]研究发现LncRNA TP53TG1通过miR-96/TPM1轴调控胃癌细胞对氟尿嘧啶的耐药性。王庆丽[24]采用RT-qPCR检测胃癌细胞和肿瘤组织中miR-96表达,发现miR-96呈高表达状态。本研究发现胃癌患者胃镜活检肿瘤组织SF3B4显著高于癌旁组织及胃良性疾病患者病灶组织,表明miR-96与胃癌发病机制密切相关。

目前胃癌病情及预后评估常用的方法包括蛋白水平的肿瘤标志物、影像学检查及病理组织TNM分期等,其中肿瘤标志物存在敏感度及特异度低等缺点,影像学检查受检查机器及阅片医生经验水平的影响,TNM分期依赖于术后病理组织学而不适用于无法取得病理组织患者,故胃镜活检组织的基因水平标志物可能更具有临床价值[25-26]。目前胃癌病情及预后评估标志物的检测多为血清检测及术后病理组织标本,前者存在敏感度低缺点,而后者存在普适性差等缺点,无法在术前提供客观证据,胃镜活检组织检测不依赖于术后病理组织学标本,可在术前提供检测标本,普适性更广及敏感度更高而更具有临床价值[27]。本研究中胃癌患者SF3B4、miR-96表达显著升高,与肿瘤分化程度、肿瘤最大直径、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、cTNM分期及预后密切相关,表明SF3B4、miR-96可作为胃癌病情及预后评估的标志物。

目前胃癌病情及预后评估标志物的检测多采用血清或病理组织标本检测,单个蛋白水平和基因水平的检测指标因其缺乏组织特异性而导致其敏感度及特异度低,临床上可通过多项指标联合检测以提高敏感度及特异度[28-29]。本研究中,SF3B4、miR-96预测胃癌1年预后不良敏感度、特异度、AUC均高于肿瘤分化程度、肿瘤最大直径、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、cTNM分期(P<0.05),SF3B4联合miR-96预测胃癌1年预后不良敏感度、特异度、AUC均高于SF3B4、miR-96单独预测(P<0.05),这些证据表明胃镜活检组织SF3B4、miR-96预测胃癌预后不良效能高于传统的检测指标,SF3B4联合miR-96检测可显著提高敏感度及特异度,在胃癌的临床诊疗过程中应密切监测SF3B4、miR-96以调整治疗方案。

综上所述,胃癌患者SF3B4及miR-96表达显著升高,与肿瘤分化程度、肿瘤最大直径、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、预后密切相关,可作为胃癌病情及预后评估的标志物,两者联合检测时可提高预测胃癌预后不良的敏感度及特异度。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

董杰:实施研究过程;杨松:统计学分析,分析试验数据,论文修改;肖俊:资料搜集整理;李鹏程:课题设计,论文撰写,论文审核