化脓隐秘杆菌动物模型的研究进展

黄艳爽，胡惠铭，慕依林，沈克飞，徐登峰，王孝友，张素辉*

（1.重庆市畜牧科学院，重庆市兽用生物制品工程技术研究中心，重庆 荣昌 402460；2.西南大学，重庆 北碚 400715）

化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes）是动物皮肤、上呼吸道和泌尿生殖道黏膜微生物群落的一部分，是一种重要的条件致病菌，可在家畜间广泛传播，导致广泛多样的皮肤、内脏器官和关节的非特异性化脓性感染，常造成动物肺炎、乳房炎、关节炎、心内膜炎、肝脓肿、子宫炎以及流产、不孕等，给养殖业带来较大的经济损失。目前对化脓隐秘杆菌感染的防控仍以抗菌药物治疗为主［1］，随着细菌的进化和抗菌药物的长期使用，导致耐药性加剧，从而影响治疗效果［2］，故亟需建立化脓隐秘杆菌感染动物模型，用于研究其致病机制、筛选药物及开发疫苗。本文就化脓隐秘杆菌动物模型的研究现状及成果进行综述。

1 动物模型的选择

可用来建立模型的动物种类繁多，对于普通细菌感染动物模型来讲，所选动物必须满足以下条件：（1）动物来源充足，操作经济简单；（2）感染持续时间够长，易于开展长期或较长期的观察；（3）纯系动物，易控制各种处理因素；（4）模型可重复性强，便于国际间对比和交流。近年来，已建立的化脓隐秘杆菌感染动物模型包括小鼠模型、大鼠模型、家兔模型、山羊模型、妊娠母猪模型、荷斯坦母牛模型等。

2 各类化脓隐秘杆菌动物模型

2.1 小鼠模型 小鼠与人的基因具有95%的同源性，与其他经济动物的基因也有高度的同源性，且生理结构大致相同，例如小鼠乳腺与奶牛乳腺生理结构几乎相同［3］，小鼠还具有价格低廉，繁殖性能强等优势，因而小鼠模型在疾病研究中被广泛使用。

Qin Lei 等［4］从患有肺炎和严重腹部积液的病保育猪的肺部分离出一株化脓隐秘杆菌菌株20121，并且成功构建了小鼠化脓隐秘杆菌感染模型，在感染小鼠中观察到肺充血、肝细胞广泛变性、十二指肠黏膜下淋巴组织中淋巴细胞大量坏死、回肠中潘氏细胞变性、脾脏白髓萎缩等一系列症状，肺部检测出细菌（＞104CFU/g）。该模型初步证明化脓隐秘杆菌在感染的早期阶段会降低免疫功能，其作用机制尚不清楚，有待进一步研究。

疫苗研发是防治化脓隐秘杆菌感染的新方向。Yang Lingxiao 等［5］构建了tPLOA1和tPLOA2两种重组抗原，通过将两种重组抗原与不完整的弗氏佐剂或绵羊红细胞膜混合来制备疫苗，以清洁雌性昆明小鼠为模型，经过3次疫苗免疫后，用化脓隐秘杆菌进行攻毒实验，分析免疫保护效果。结果显示：免疫两种重组抗原的小鼠未表现出任何不适，且未观察到注射部位周围的皮肤病变；虽然重组抗原对动物是安全的，但疫苗只能保护约50%的小鼠。这一结果表明抗原和疫苗制剂的效力不足，有待进一步研究。

疫苗开发的另一种思路是构建减毒活疫苗，该类疫苗能够模仿自然感染和天然佐剂特征，诱导机体长期免疫力，并从天然细菌入侵途径进行管控。Beikzadeh B 等［6］构建减毒活菌作为候选疫苗，通过荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）评估PLO 和FimA 两种毒力基因的表达情况，与对照组相比，PLO 和FimA 基因表达下调；通过腹膜注射途径对小鼠进行攻毒实验，小鼠脾脏外观正常，而接种疫苗的小鼠和对照组的脾、肝、心和腹液细菌计数无显著差异。该试验成功构建了自然感染无致病性化脓隐秘杆菌的小鼠模型，为化脓隐秘杆菌提供了一种新的减毒疫苗，接下来需要对免疫反应及安全性进行更多的研究。

2.2 大鼠模型 大鼠的体型较家兔等哺乳动物小，内脏器官更容易观察和分析，且研究成本较低，但大鼠模型可能无法成功诱导目的疾病。例如使用化脓隐秘杆菌悬浮液进行大鼠子宫灌注可能会导致子宫炎或阴道炎，而不是子宫内膜炎，故需要更精细的操作。Zhang Luyao等［7］建立大鼠子宫内膜炎模型时，在灌注化脓隐秘杆菌前，连续3 d 将3%乙酸注射到子宫角，以化学损害子宫，在细菌首次接种后将硅水凝胶透镜植入大鼠子宫以形成生物膜，通过激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察硅水凝胶镜片上形成的生物膜证明化脓隐秘杆菌在大鼠子宫中的存在。同时，观察大鼠的临床症状、体温、白细胞分类改变、子宫内细菌含量、形态和病理改变，判断模型诱导是否成功。大鼠作为动物模型具有一定的局限性，其病理过程和其他动物可能不完全一致，具体的疾病机制还需探索。

2.3 家兔模型 Hijazin M等［8］首次从家兔的肺部病变中分离出化脓隐秘杆菌，Shahbazfar A A等［9］首次从家兔肝、脾、肺、脑中分离得到化脓隐秘杆菌。谷长勤等［10］使用鸭源化脓隐秘杆菌菌悬液通过腹腔和皮下注射家兔，建立攻毒模型，运用病理学技术观察鸭源化脓隐秘杆菌对家兔的致病特点，除以往学者报道的哺乳动物感染后的病变外，还观察到脾内白髓面积减少，表明该菌会对免疫系统造成损伤，但同时观察到部分家兔的心包积液增多，这与Qin Lei等［4］构建的小鼠模型有一定差异。

刘威等［11］通过构建家兔的高免血清模型进行免疫荧光分析（IFA）、特异性试验等，成功建立了一种检测化脓隐秘杆菌的间接免疫荧光方法，该方法能对化脓隐秘杆菌在感染动物组织细胞中定位，有利于全面和系统地了解化脓隐秘杆菌的发病机理和流行状况。

2.4 妊娠母猪模型 建立化脓隐秘杆菌妊娠母猪模型，可研究存在于母猪乳汁中的生理活性物质对化脓隐秘杆菌的免疫潜质。Kostro K等［12］使用适量的苯酚溶液灭活化脓隐秘杆菌制备自体疫苗（菌悬液密度为6×108CFU/mL），在妊娠母猪预期分娩前六周和三周分别免疫（3mL/头·次），结果显著增加了初乳和牛奶中T 淋巴细胞CD4＋、CD8＋和CD25＋的百分比以及干扰素IFN-γ、肿瘤坏死因子TNF-α和白细胞介素IL-10 的水平，表明分娩前免疫化脓隐秘杆菌疫苗，可提高初乳免疫潜力，增强仔猪在断奶期间对化脓隐秘杆菌感染的抵抗力，从而减少化脓隐秘杆菌感染引起的猪场经济损失。

2.5 荷斯坦母牛模型 小鼠模型在动物模型构建中得到大量使用，但事实上从经济动物所面临的疾病困扰来说，小鼠模型并不完全适用于所有疾病。基于此，Piersanti R L 等［13］使用致病性大肠杆菌和化脓隐秘杆菌，以荷斯坦小母牛为模型，通过载体或活菌宫内输注的方法，成功构建了一个实验诱导的临床子宫内膜炎体内感染模型。该模型可用于研究子宫内膜炎相关生殖衰竭的机制和子宫内膜炎介导的低生育力，并且规避了在哺乳期奶牛中观察到的分娩和哺乳的许多混杂效应。

2.6 山羊模型 构建山羊模型可以更好地理解致病菌在宿主中的生命周期、传播和菌群动态，这对于研究细菌感染的病理过程和发展非常有帮助。王晨骁［14］从患病山羊脓汁中分离筛选出一株同时含有七种毒力基因的化脓隐秘杆菌，每只皮下注射3×108CFU 的菌液进行致病性试验，感染一周后接种部位有明显肿包产生，注射器刺破后有脓液流出，采集脓液进行病原分离鉴定，再次分离到化脓隐秘杆菌。该模型的构建有利于探究化脓隐秘杆菌对山羊的致病性及致病机制。

2.7 其他动物模型

2.7.1 白勒霍恩鸡模型 2017 年Yang Lingxiao等［15］将纯化的重组PLO与弗氏完全佐剂混合，皮下注射免疫白勒霍恩鸡，两周后注射第二剂相同剂量的重组PLO与弗洛因德不完全佐剂混合物，在第二次免疫接种10 d后，处死动物，收集血清，进行蛋白免疫印迹试验。该模型的构建为PLO结构与功能的验证研究提供了一些新的信息，并且作为禽类模型具有体外孵化易于控制、试验成本低等优点。

2.7.2 猪的精确切割肺切片（PCLS）3D模型 Qin Lei等［4］首次使用化脓隐秘杆菌20121菌株感染猪的肺切片（PCLS）培养物，发现化脓隐秘杆菌可诱导严重的支气管收缩并导致细支气管管腔面积变窄，表明PCLS 是研究化脓隐秘杆菌感染合适的3D 模型。此外，PCLS 可用于寻找更有效的化脓隐秘杆菌感染的治疗药物。

3 小结

前期调查发现，重庆地区某规模场山羊感染化脓隐秘杆菌的抗体阳性率达到31%［16］。可见化脓隐秘杆菌作为一种引起各种化脓性感染的机会性动物病原体，给畜牧业造成了比较大的经济损失。建立化脓隐秘杆菌感染动物模型，对于其致病机制研究、药物筛选及疫苗研制具有重要意义。目前大多数关于化脓隐秘杆菌感染保护性免疫的研究是在小鼠模型上进行的，小鼠模型较其他动物模型成熟，但在病理发展机制的研究、疫苗效力评价等方面仍有尚未解决的问题。大鼠和荷斯坦牛模型主要侧重于子宫内膜炎疾病模型的构建。家兔模型与山羊模型在疫苗研制过程中发挥了重要作用，有较大的开发潜力。可根据动物特性尝试构建更多相关模型，进一步探究化脓隐秘杆菌在体内的感染机制，以进行药物筛选和疫苗评价。