胰岛素-葡萄糖信号通路调控哺乳动物卵泡发育的机制

王若桐，刘春洁

（ 塔里木大学动物科学与技术学院 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300 ）

大量研究证实，葡萄糖存在于人类[1]、猕猴[2]、水牛[3]、绵羊[4]、牛[5]、猪[6]、骆驼[7]和马[8]的卵泡液中，主要作为颗粒细胞生长所需的能量。葡萄糖在卵泡液中的含量低于血清，不同种动物的卵泡液、血清中葡萄糖的含量也各不相同。有研究发现，直径大的卵泡中葡萄糖含量显著高于直径小的卵泡，且排卵前卵泡中葡萄糖的含量达到最高[4,9-10]，表明在同一生理条件下，不同卵泡在不同发育阶段所需能量也存在差异。胰岛素与胰岛素受体（IR）的结合导致一系列细胞内信号传导事件，可调节多种生物过程，如葡萄糖和脂质代谢、基因表达、蛋白质合成以及细胞生长、分裂和存活。

卵泡液是卵母细胞赖以生长成熟的微环境，其中的胰岛素样生长因子（IGF）对卵母细胞的发育、成熟、排出以及受精后胚胎的形成具有重要的影响。葡萄糖受到胰岛素信号、腺苷酸活性蛋白激酶（AMPK）和己糖胺途径等胞内多重机制感应，是机体代谢最基本的能量底物。己糖胺合成途径被认为是能量状态的“传感器”，用于调节相关基因表达，进而调节卵泡的发育功能[11]。本文综述了胰岛素-葡萄糖信号通路在哺乳动物卵泡发育过程中的调控机制，以期为哺乳动物繁殖领域的相关研究提供参考。

1 葡萄糖调节卵泡代谢机制

正常卵泡发育过程中所需的能量主要依靠颗粒细胞，并通过其细胞膜上的葡萄糖转运蛋白（GLUT）摄取周围组织中的葡萄糖完成[12]。葡萄糖在哺乳动物卵母细胞中的主要代谢方式是糖酵解、戊糖磷酸化（PPP）和三羧酸循环，其在卵母细胞代谢中对体外卵母细胞成熟、受精以及后续胚胎发育潜能[13-17]均具有显著影响。卵泡液中的乳酸含量随着卵泡直径和卵泡液增加而逐渐增加；葡萄糖的含量则与卵泡直径呈负相关，一般卵泡直径越大，葡萄糖含量越低。发育中的卵泡具有很高的糖酵解活性。有研究结果显示，使用高浓度的葡萄糖、丙酮酸和乳酸联合培养颗粒细胞可显著提高其增殖能力[18]。

高浓度葡萄糖能够抑制卵母细胞体外成熟，因此PPP或糖酵解在小鼠卵母细胞减数分裂中至关重要。但也有研究发现，奶牛、山羊和绵羊的卵泡中葡萄糖含量随着卵泡直径增加呈上升趋势[19]。卵母细胞无法直接利用糖酵解供能，而颗粒细胞从原始卵泡开始即表现出较强的糖酵解活性[20]。此外，颗粒细胞中磷酸果糖激酶（PFK）及乳酸脱氢酶（LDH）的表达显著高于其在卵母细胞中的表达，并且PFK 和LDH 在窦卵泡中的表达最强，其糖酵解产生的丙酮酸和乳酸可作为卵母细胞的主要能量来源[21]。

2 胰岛素调节体内外卵泡机制

IGF-1与受体结合后可促进颗粒细胞增殖和雌激素合成，并促进卵泡进一步发育。IGF-1具有增强促性腺激素促进卵泡发育的作用，可刺激雌激素合成增加以及氨基酸积蓄，同时还能够诱使未成熟的卵母细胞自发成熟并进行良好的分裂。已有研究表明，在卵巢的颗粒细胞区，IGF-1与促卵泡生成素（FSH）可相互促进对方受体表达，从而增强相互的生物效应，为卵泡发育提供更多能量。IGF-1与促性腺激素（LH）具有协同作用，可诱导卵泡内膜细胞LH受体表达，同时促进卵泡内膜细胞增殖。IGF-1灭活可导致卵泡的生长和发育停滞，使用促性腺激素也无法使卵泡继续发育[22]。

胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）分子量最小的是胰岛素样生长因子结合蛋白4（IGFBP-4），在所有生物体内均以糖基化和非糖基化等两种形式存在。体外试验结果显示，IGFBP-4抑制了IGF-I与纯化的IGF-1 R结合，作为IGF 的高效抑制剂对卵巢生理功能具有重要影响。在雄激素优势卵泡和生长停滞卵泡的卵泡液中IGFBP-4的水平均较高[23]，但在人体内IGFBP-4能够抑制卵巢类固醇生成。有研究指出，IGFBP-4通过抑制卵巢IGF的功能进而抑制卵泡发育；胰岛素可影响卵泡在体内的发育[24]。尽管大多数体内研究数据验证了这一结果，但体内和体外的研究结果仍存在一些差异，主要区别是：颗粒细胞可能通过刺激雌二醇（E2）产生体外胰岛素，而体内胰岛素却能够抑制卵巢内E2分泌。有研究通过幼龄大鼠卵巢的灌注试验表明胰岛素能够促进细胞有丝分裂并且抑制E2的分泌。注射葡萄糖或生糖饮食均可提高血清中葡萄糖含量，增加卵泡数目和刺激胰岛素分泌，而降低卵泡内E2的含量和细胞色素P45019a1（CYP19a1）的转录水平[25-27]。有研究通过建立绵羊自体移植模型发现体内灌注胰岛素能够增加外周血中葡萄糖的含量，无法促进卵泡内类固醇生成；灌注葡萄糖时，卵泡内类固醇被抑制。体内胰岛素、类固醇生成需要摄取葡萄糖，并降低促分裂原活化蛋白激酶（Akt/ERK）和腺苷酸活性蛋白激酶（AMPK）磷酸化水平。葡萄糖能够刺激产后奶牛胰岛素分泌，促进卵泡发育和卵巢周期恢复，但不利于胚胎存活[21,28]。此外，葡萄糖能够刺激底物与FSH 或LH 受体结合，进而诱导孕激素（P4）和E2分泌，同时也能够诱导类固醇的生成[29]。

在大多数体外培养的颗粒细胞和膜细胞的应答机制中，胰岛素能够刺激细胞增殖和类固醇生成。但也有研究发现，颗粒细胞中高浓度胰岛素不能刺激类固醇生成，是由于高浓度胰岛素刺激P4和雄激素分泌的能力高于对E2的刺激。胰岛素还可直接刺激颗粒细胞增殖、谷氨酰胺合成酶（GS）活性、葡萄糖转运、游离脂肪酸积累，并能够促进LH诱导低密度脂蛋白受体表达。胰岛素通过诱导人类和动物膜细胞刺激雄激素分泌，为颗粒细胞E2合成提供底物[30-31]。在大鼠膜细胞中，胰岛素不但能够刺激细胞增殖，还可通过诱导细胞周期激酶4（CDK4）蛋白调节细胞周期。细胞周期蛋白D3 和增殖细胞核抗原（PCNA）均被雷帕霉素（mTOR）阻断，表明激活的胰岛素参与雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）信号通路的调控[32]。高浓度胰岛素能够刺激体外卵母细胞的分裂和成熟[33]，但体内长期存在高浓度胰岛素会对卵母细胞发育造成负调控。此外，在一项牛的研究中证实，高胰岛素血症与卵母细胞质量受损程度相关。排卵前卵泡中胰岛素的含量高于次级卵泡，由此推测卵泡中适量的胰岛素能够促进体内卵母细胞成熟，胰岛素浓度过高则对卵母细胞发育具有负影响。

3 胰岛素-葡萄糖信号通路调控卵泡代谢机制

3.1 Akt信号通路

目前已鉴定哺乳动物中至少存在11 个胰岛素受体底物（IRS），包括胰岛素受体底物Shc等。人体中检测到额外的两个IRS对接蛋白4和5涉及胰岛素信号，但不参与激活磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）。肌肉和脂肪组织中的IRS-1是刺激葡萄糖转运的底物，而肝脏中的IRS-1 和IRS-2 对胰岛素信号转导和葡萄糖代谢具有互补作用。细胞内IR的主要信号转导途径是PI3K/Akt 和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）[34]。PI3K 途径的生物学效应可能是通过磷脂磷酸酶负调控三磷酸化的脂酰磷酸肌醇PIP3水平，去磷酸化而失活，之后活化3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1），进一步促使蛋白激酶B（Akt/PKB）发生磷酸化。综上所述，哺乳动物胰岛素通过IR或IRS诱导PI3K/Akt和MAPK转导途径，进而发挥其对细胞的调控作用。

Akt 包含3 种由基因单独编码的异构体，也是胰岛素信号通路的一个关键分支点。激活的Akt 直接发生磷酸化，同时伴随结节性硬化症复合物2（TSC2）和糖原合成酶激酶-3（GSK3）失活，激活凋亡抑制因子（Bcl-2）相关死亡促进者和叉头型转录因子O1（FOXO1）。John等[35]研究表明，PI3K/AKT/FOXO3信号与卵巢功能密切相关。在卵泡发育过程中，PI3K/AKT 的激活导致叉头型转录因子O3（FOXO3）磷酸化和核输出，从而触发原始卵泡激活。在原始卵泡发育过程中，FOXO3为非磷酸化并定位于细胞核，抑制原始卵泡激活。Li等[36]研究表明，卵母细胞中的组成型活性FOXO3能够提高小鼠卵巢的生殖能力。

哺乳动物的靶标雷帕霉素（mTOR）包括mTOR复合物-1（mTORC1）和mTOR复合物-2（mTORC2），是结构和功能均不同的蛋白复合体。FOXO1发生磷酸化后直接负调控转录因子的活性和上游因子TSC2，参与mTORC1合成。研究发现，mTOR 与调控mTOR 相关蛋白显著相关，也是调控细胞生长、增殖和mRNA 转运的关键因子；其次，mTOR 与雷帕霉素不敏感mTOR 伴侣还具有促进肌动蛋白细胞骨架重排、细胞存活及细胞循环进程等功能。真核起始因子4E结合蛋白质1（4E-BP1）和p70核糖体S6激酶1（S6K1）的主要功能是调控蛋白质合成，是mTORC1下游的两个最佳靶标。Akt 对胰岛素的应答机制导致FOXO1从核中移出并发生磷酸化，从而阻止其在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）作用下发生转录。此外，Akt 也可通过磷酸化抑制剂发挥抗细胞凋亡作用。有研究指出，抑制PI3K/Akt 通路几乎能够阻止哺乳动物体内所有关于胰岛素的代谢活动，包括刺激葡萄糖转运、糖原合成和脂质合成等[36]。

Das 等[37]试验结果显示，胰岛素可间接增加促性腺激素受体或LH 受体的数量。胰岛素可与FSH 协同作用，促进卵巢卵泡膜间质细胞的分化和增殖。此外，Saltiel 等[33]研究表明，胰岛素也可刺激培养颗粒细胞和卵泡膜细胞的类固醇生成和细胞增殖。研究发现，胰岛素可调节人类卵巢雄激素产生，提供了培养人卵泡膜细胞分泌雄激素的证据。上述研究表明，胰岛素在早期卵泡的形成中起到促进卵泡生长发育的间接作用。然而，Pitetti等[38]研究表明，胰岛素受体可能并非卵母细胞生长必需，因为胰岛素受体缺失并不影响卵母细胞发育或正常的发情周期。

3.2 GLUT促使葡萄糖的摄取

目前已报道了哺乳动物中的13 种葡萄糖转运体（GLUT），其中葡萄糖转运蛋白1（GLUTs 1）和葡萄糖转运蛋白4（GLUTs 4）在绵羊卵泡中均有表达；GLUTs 1、葡萄糖转运蛋白3（GLUTs 3）及GLUTs 4 的mRNAs 在牛黄体期的卵泡中表达[39]；GLUTs 1、GLUTs 3 和GLUTs 4 的mRNAs 在大鼠卵巢中表达。有研究发现，GLUTs 1、GLUTs 3、葡萄糖转运蛋白5（GLUTs 5）、葡萄糖转运蛋白8（GLUTs 8）的mRNAs 呈结构性表达。而多囊卵巢综合征患者的颗粒细胞中不表达葡萄糖转运蛋白2（GLUT 2）和葡萄糖转运蛋白7（GLUT 7）的mRNAs。GLUTs 4 的mRNAs 优先在肌肉和脂肪组织中表达，还能够刺激胰岛素诱导葡萄糖摄取的信号应答机制[40]。研究发现，胰岛素衍生的信号通路也可调控GLUTs 4 转录水平，包括PI3K、PDK1/2和非典型蛋白激酶C（PKC）的激活，推测可能是通过卵泡内的因子（E2、IGF-1 和白细胞介素-1β、FSH 等）刺激GLUTs 的表达，进而调控卵泡发育，导致卵泡成熟和排卵[40]。也有研究发现，牛卵泡液中葡萄糖含量与颗粒细胞中GLUTs 1 和GLUTs 3 的mRNA 表达量呈显著负相关。上述研究表明，卵泡中激素能够诱导葡萄糖摄取。GLUTs在卵母细胞中处于非功能性状态，卵母细胞通过卵丘细胞的空隙连接诱导GLUT转运，促使葡萄糖摄取[40]。

次级卵母细胞转化为成熟卵母细胞过程中涉及多个胰岛素信号下游靶基因的调控，胰岛素可诱导Atk 发生磷酸化，进而调控丝氨酸/苏氨酸激酶。小鼠卵母细胞中，颗粒细胞中转录因子可溶性试剂盒配体（KL）调控PI3k/Akt信号途径，由于Akt1介导在丝氨酸21中的GSK3α或在丝氨酸9 中的GSK3β，进而导致GSK3 的激活。牛卵巢中，GSK3 定位于颗粒细胞和卵母细胞胞质中，表达于整个卵泡中。GSK3 激酶位于卵母细胞中期-Ⅱ（MⅡ）与第一极体之间的区域。而使用特异性抑制剂影响GSK3β从MⅠ到MⅡ过渡调控功能，可能是由于Aurora A 激酶参与GSK3β激活[41]。

FOXO蛋白作为核转录因子并介导胰岛素或IGF-1在其不同途径中的关键功能存在的抑制作用[42]。作为对增加的胰岛素或IGF-1 信号的响应，FOXO 蛋白经历胰岛素介导的磷酸化和从细胞核到细胞质的易位，导致靶基因表达抑制[41-43]。FOXO3 也是IκB 激酶的直接靶点，IκB 对FOXO3 的磷酸化可调节几种细胞因子的依赖性途径[44]。FOXO1 和FOXO3a 也可调控卵泡生成[45]。FOXO3a 在早期初级卵泡的卵母细胞核中表达，在原始卵泡的卵母细胞和生长卵泡中的表达呈显著性下调[46-47]。哺乳动物中FSH-非依赖性卵泡主要介导FOXO3a，进而负调控早期卵泡活性和卵泡发育，实际是抑制原始卵泡生长和控制原始卵泡的存活率。小鼠敲除试验已证实，FOXO3a 并非由于GSK3作用于FSH-非依赖性激素促使卵泡的生长和发育，但FOXO3a失活后却使卵泡生殖能力迅速下降，增加闭锁卵泡数量及原始卵泡池的损耗。小鼠卵母细胞中FOXO1 mRNA的表达量不同发挥功能不同，但在没有足够数量代替FOXO3a的情况下不表达[35,48]。FOXO1和FOXO3a作为胰岛素激活AKT的靶基因调控哺乳动物卵泡生长或闭锁，促使哺乳动物卵泡形态和生理发生功能性变化。

4 结论

胰岛素介导葡萄糖摄取对于哺乳动物生产（奶牛、小反刍动物和猪）以及一些人类生殖医学领域的相关研究均具有极其重要的影响。卵泡功能受胰岛素和胰岛素-葡萄糖系统直接或间接调控。因此，在颗粒细胞中，胰岛素信号通过Akt1、FOXO1 和FOXO3 传导，能够增强类固醇生成和卵巢发育。Akt1 增强胰岛素通过己糖胺途径刺激葡萄糖转运，却抑制类固醇生成。膜细胞研究中证实胰岛素信号通过Akt1能刺激磷酸二酯酶（PDE）抑制cAMP降解，并因此增强雄激素生成，胰岛素在Akt1/FOXO1 作用下可刺激类固醇生成，通过mTOR或ERK途径能够促进细胞增殖和蛋白质合成，并抑制细胞凋亡。

卵泡发生是一个动态过程。大量试验揭示，胰岛素/FOXO1 途径似乎对卵泡阶段性发育具有特异性效应：小卵泡能够刺激颗粒细胞增殖；中等大小的腔卵泡能够刺激类固醇生成；排卵时闭锁的卵泡受到刺激。但目前关于调控阶段性、特定效应的报道相对罕见，因而针对FOXO1调控机制有待进一步研究和完善。本文综述了胰岛素-葡萄糖信号通路在哺乳动物卵泡发育过程中的调控机制，挖掘胰岛素-葡萄糖信号途径影响哺乳动物卵泡发育重要信息，以期为哺乳动物繁殖领域的相关研究提供一定参考。