葡萄MYB转录因子基因VvMYB30的克隆及其耐盐性分析

解振强，许桓瑜，黄金霞，蔡善亚，李刚，赵鹏程*

（1.江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400；2.扬中市经济开发区管委会，江苏扬中 212200）

葡萄作为重要的经济果树在优化农业结构和促进农民增收等方面发挥了重要作用。然而，环境污染、灌溉和施肥不当等造成的土壤盐渍化严重降低了葡萄的产量和品质，同时我国沿海滩涂等盐碱地也制约着葡萄的推广种植[1-2]。为了减少盐碱造成的损失，除进行土壤改良和耐盐砧木嫁接外，挖掘耐盐基因并通过基因工程育种已成为果树遗传改良中高效可行的手段。

MYB转录因子是植物中最大的一类转录因子家族，其中多数为R2R3型，而R2R3-MYB转录因子又可聚类为25个亚类[3]。已有的研究表明，Subgroup I亚类成员通过多种通路广泛参与了植物的胁迫响应。Zhao等[4]发现，在拟南芥中，过表达小麦TaMYB31可促进蜡质合成及耐旱基因的表达，提高植株的耐旱性；拟南芥AtMYB30则可通过ROS通路及钙信号通路参与盐、氧化和高温等胁迫信号的传递与正向调节[5-6]。而对AtMYB96的研究表明，其可经由ABA信号通路正调控植株对干旱和冷胁迫的耐受性[7-8]。除作为正调节因子外，该亚类成员还可负调节植株的耐逆性，如Lyu等[9]对水稻OsMYB30的功能研究发现OsMYB30通过降低麦芽糖的含量负调控水稻的耐寒性。目前，从葡萄基因组中共鉴定到131个R2R3-MYB转录因子[10]。已有的功能研究表明，其参与调控了葡萄中原花青素、花青素和二苯乙烯等次生代谢物的合成。如过表达VvMYB4、VviMYB86和VvMYBC2L2可抑制植株体内花青素的合成，其中VviMYB86还可促进原花青素的合成[11-13]。也有研究表明，VvMYBA1和VvMYBA2通过调控花青素的生物合成控制葡萄的浆果颜色[14]。此外，Holl等[15]发现，在葡萄毛状根中过表达VvMYBA14和VvMYBA15能够显著促进白藜芦醇前体物质二苯乙烯的合成。然而，葡萄MYB转录因子参与耐逆调控的报道还较少。其中，过表达VvMYB6可提高转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐受性，耐盐砧木‘1103P’中的VvMYB62正调控植株的耐盐性[16-17]。而Zhang等[18]的研究发现，将野生葡萄VaMYB44在拟南芥和葡萄愈伤组织中过表达则降低了耐寒性。

本研究以‘阳光玫瑰’葡萄中MYB转录因子Subgroup I亚类成员VvMYB30为对象，通过对其进化关系、表达模式、亚细胞定位、转录激活活性和耐盐性进行分析，探究其在葡萄耐盐响应过程中的生物学功能，为葡萄的耐盐分子育种提供候选基因资源。

1 材料与方法

1.1 植物材料及处理

葡萄材料来自于江苏省农博园无土栽培的3年生欧美杂交种葡萄‘阳光玫瑰’，正常生长条件下，于初花期采集各组织器官样品，并在果实发育的不同时期采集果实样品，各样品经液氮速冻后置于-80 ℃冰箱内保存。盐胁迫处理：以当年生扦插苗为试材，清洗后将其置于1/2 Hoagland培养液中培养1周，然后转移至含200 mmol•L-1NaCl的培养液中进行盐处理，分别在处理0、6、12、24、36、48 h后采集相同位置的成熟叶片，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱内保存。

本研究所用烟草材料为本氏烟（Nicotiana benthamiana），用于转基因的拟南芥（Arabidopsis thaliana）为Col-0。烟草、拟南芥及盐处理葡萄培养温度为24 ℃，光照周期为16 h光照/8 h黑暗。

1.2 基因克隆及载体构建

使用Spectrum植物总RNA试剂盒（Sigma-Aldrich）提取各样品的总RNA，并通过Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）和2%琼脂糖凝胶检测浓度及完整性。以RNA为模板，使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit with gDNA wiper（Vazyme）试剂盒合成cDNA，稀释50倍并分装后置于-20 ℃冰箱内保存。基于已有葡萄基因组设计特异引物，以成熟叶片cDNA为模板扩增VvMYB30的CDS序列，纯化后克隆到pMD18-T载体中并送至通用生物进行测序。依据CDS序列合成亚细胞定位引物和转录激活验证引物，扩增全长序列，通过ClonExpress II One Step Cloning Kit（Vazyme）分别将其同源重组到pCAMBIA1305-GFP和pGreenII-62-SK-GAL4BD（pBD）载体上，获得亚细胞定位载体35S::VvMYB30-GFP及效应载体pBD-VvMYB30。

1.3 亚细胞定位及转录激活验证

亚细胞定位方法：将分别含GFP及mCherry载体的农杆菌振荡培养至OD600≈0.8后离心，用侵染液（10 mmol•L-1MES、10 mmol•L-1MgCl2和200 μmol•L-1AS）重悬菌体至OD600≈0.2，放置2 h后，将不同侵染液等体积混合并注射入本氏烟草叶片，在培养箱中培养2～3 d后，用激光共聚焦显微镜观察荧光信号并拍照。

转录激活验证方法：参考Wang等[19]的研究进行，将构建好的效应载体组合报告载体转入烟草叶片，共进行6次生物学重复。在培养箱中培养2～3 d，参照双萤光素酶报告基因检测试剂盒（Yeason）使用说明，检测萤火虫萤光素酶及海肾萤光素酶报告基因的活性。将LUC/REN比值与对照组进行归一化处理，所产生的数值表示活性强弱。

1.4 荧光定量PCR分析

利用Primer Premier 5.0设计VvMYB30的定量引物，以VvACTIN为内参基因。荧光定量PCR反应体系包括：2×SYBR Green Supermix 10 μL、上、下游引物各1 μL、稀释后的cDNA8 μL，ddH2O补足至20 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。利用2-ΔΔCT法分析基因的相对表达量。

1.5 拟南芥遗传转化及耐盐性鉴定

将35S::VvMYB30-GFP载体通过花序侵染法转至拟南芥Col-0中，利用含25 mg•L-1潮霉素的1/2 MS抗性培养基以及PCR检测扩增目的基因的方法进行逐代筛选，最终获得T3代纯合转基因株系。通过RT-PCR鉴定VvMYB30在转基因株系中是否转录，并进一步利用qRT-PCR检测各株系中VvMYB30的表达量，从中选取表达量较高的株系用于耐盐性鉴定。将消毒后的野生型和转基因拟南芥种子分别点播于含有0或125 mmol•L-1NaCl的1/2MS培养基上，4 ℃春化3 d，然后将其置于光照下培养，并统计7 d内的发芽情况，共进行3次生物学重复。萌发率（%）=(发芽种子数/供试种子数)×100。

将在培养基上生长7 d的野生型和转基因拟南芥分别移栽至方盆中，每盆9株。待植株生长20 d后进行盐处理，处理方法为每隔3 d浇灌一次300 mmol•L-1NaCl溶液。处理7 d后统计植株存活率，共进行3次生物学重复。存活率（%）=(处理后的存活株数/总株数)×100。

2 结果与分析

2.1 VvMYB30的克隆及生物信息分析

以‘阳光玫瑰’葡萄成熟叶片cDNA为模板，进行PCR扩增并对其产物进行测序和BLAST分析，其与拟南芥AtMYB30具有较高的同源性，相似度为60.54%，故暂命名为VvMYB30。VvMYB30基因全长984 bp，编码327个氨基酸，其蛋白分子量为36.54 kDa，等电点为5.69，平均疏水指数（GRAVY）为-0.779，为亲水性蛋白。

使用MEGA7.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joining）构建VvMYB30与拟南芥、甜橙、水稻等其他植物MYB转录因子的系统进化树。结果发现VvMYB30与甜橙CsMYB30的亲缘关系最近，相似度为64.75%，推测二者可能具有相近的生物学功能（图1A）。序列比对结果显示，VvMYB30与亲缘关系较近的 MYB30蛋白的氨基酸相似度在56.98%～64.75%，不同植物MYB30蛋白间的氨基酸数量有较大差异，但在N端序列具有高度的保守性，均含有1个保守的R2R3结构域（图1B）。

图1 VvMYB30及其同源蛋白的进化树（A）和多序列比对（B）分析Figure 1 Phylogenetic (A) and multiple amino acid sequence alignment (B) analysis of VvMYB30 and its homologs from diあerent plant species

表1 VvMYB30基因克隆及功能分析所用引物Table 1 Primer used for VvMYB30 gene cloning and functional analysis

2.2 VvMYB30的亚细胞定位及转录激活分析

将35S::VvMYB30-GFP载体与细胞核标签载体（35S::AtHY5-mCherry）在本氏烟叶片中瞬时表达。激光共聚焦显微镜观察发现，空GFP蛋白分布在细胞质及细胞核内，而VvMYB30-GFP融合蛋白主要分布在细胞核（如图2A），表明VvMYB30定位于细胞核，属于核蛋白。

图2 VvMYB30的亚细胞定位及转录激活分析Figure 2 Subcellular localization and transcriptional activation analysis of VvMYB30

通过双荧光素酶试验确定VvMYB30在植物体内的转录激活活性，将GAL4 DNA结合结构域与VvMYB30融合表达获得效应载体；报告载体REN基因由35S驱动，LUC基因由5×GAL4激活域序列驱动（图2B）。将效应载体与报告载体在烟草叶片中瞬时表达并测定双荧光素酶活性，结果显示pBDVvMYB30效应载体的LUC/REN值显著高于阴性对照，为对照的3.28倍（图2C），表明VvMYB30具有转录激活活性。

2.3 VvMYB30在葡萄组织中的表达分析

qRT-PCR分析发现，VvMYB30在葡萄不同发育时期的果实中呈高表达，约为根部表达量的7.06～10.12倍；其次是花和成熟叶片，分别为根部的4.20和4.35倍，而在根和茎中表达量较低（图3A）。VvMYB30受高盐胁迫，处理24 h后表达量达到最高，为对照的6.86倍，并且在48 h仍然保持在较高水平（图3B），表明VvMYB30属于盐胁迫诱导基因。

图3 VvMYB30基因在葡萄不同组织（A）及盐胁迫（B）的表达分析Figure 3 Expression analysis of VvMYB30 in diあerent tissues(A) and salt stress (B) of 'Shine-Muscat' grape

2.4 过表达VvMYB30提高拟南芥的耐盐性

利用花序侵染法将VvMYB30在拟南芥转化，筛选共获得5个纯合株系，RT-PCR结果如图4A。利用qRT-PCR检测纯合株系中VvMYB30的表达水平，从中挑选2个表达量较高的株系用于耐盐性分析（图4B）。

图4 过表达VvMYB30拟南芥的分子鉴定Figure 4 Molecular identification of VvMYB30 ectopic expression lines in Arabidopsis

将野生型和2个过表达株系的拟南芥种子置于含125 mmol•L-1NaCl的培养基上，每天统计萌发情况。结果表明，在不含NaCl的培养基上，在同一天内野生型和2个过表达株系的萌发率均无显著差异（图5A），但在盐胁迫处理后，2个过表达株系的萌发率均显著高于野生型（图5B），表明在拟南芥中过表达VvMYB30可显著促进盐胁迫下种子的萌发。为进一步鉴定过表达VvMYB30拟南芥的耐盐性，对生长20 d的拟南芥植株进行NaCl溶液浇灌，在7 d后统计存活率。结果如图6所示，盐胁迫处理后2个过表达株系的存活率分别为40.74%和44.44%，均高于野生型。综上结果表明，过表达VvMYB30可显著增强拟南芥的耐盐性。

图5 NaCl处理对拟南芥种子萌发的影响Figure 5 Eあects of NaCl treatment on seed germination of Arabidopsis

图6 NaCl处理对拟南芥幼苗存活率的影响Figure 6 Eあects of NaCl treatment on the survival rate of Arabidopsis seedlings

3 讨论

土壤盐渍化严重影响着葡萄的推广种植和果实品质，挖掘葡萄耐盐基因对于葡萄的遗传改良具有指导作用。其中，MYB转录因子作为植物中最大的一类转录因子家族，在调控植物耐逆响应过程中发挥关键作用。本研究从‘阳光玫瑰’葡萄中克隆到1个受盐胁迫诱导表达的MYB转录因子基因VvMYB30，其编码的VvMYB30蛋白与其他物种的MYB30蛋白亲缘关系最近，同属于MYB转录因子家族Subgroup Ⅰ亚家族成员。同源性分析表明，它们在蛋白N端均存在1个高度保守的R2R3结构域，而C端则同源性较低，C端区域的差异可能影响着MYB转录因子的转录激活[20]。这一结构特征也与其他MYB亚家族一致[21]。

VvMYB30在其他植物中的同源蛋白已被证实广泛参与对非生物胁迫的应答过程，如水稻中OsMYB30负调控耐寒性[9]，甜橙CsMYB30可提高转基因拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受性[22]，拟南芥AtMYB30参与对盐、氧化和热胁迫的应激反应[5,6]。本研究发现，VvMYB30受盐胁迫诱导上调表达，暗示其可能参与葡萄的耐盐性响应，进一步在拟南芥中过量表达VvMYB30可促进拟南芥在盐胁迫下种子的萌发率及幼苗的存活率，表明VvMYB30正向调控植物的耐盐性。该结果与同源蛋白AtMYB30和CsMYB30的研究结果一致[5,22]。但是，本文未设置空载体对照，在后期的深入研究中将会加入空载体对照，以便于得出更严谨的结论。

前人研究发现，拟南芥AtMYB30通过激活交替氧化酶AtAOX1a的表达维持细胞氧化还原稳态来增强耐盐性[5]，番茄SlMYB30可能与正调控盐胁迫的BZR转录因子SlBZR1互作调控耐盐性[23]，而甜橙CsMYB30及拟南芥AtMYB96则是通过调控蜡质合成基因的表达提高植株的耐盐性[22,24]。上述结果表明，MYB30转录因子可通过多种途径调控植物的耐盐性。本研究中VvMYB30定位于细胞核且具有转录激活活性，这为其通过与启动子区结合来激活或抑制靶基因的表达提供了可能，但通过调控哪些耐盐基因转录有待深入研究。

此外，本研究中VvMYB30在葡萄各组织中具有不同的表达模式，在花和果实中高表达，而在根、叶中低表达，这与甜橙CsMYB30的组织表达模式基本一致[22,25]。VvMYB30的同源基因CsMYB30、MdMYB30、AtMYB30和SlMYB31等均被证实为烷烃等蜡质合成基因的正调控因子[22,26-28]。此外，研究还发现VvMYB30在葡萄果实中与蜡质合成基因VvCER、VvKCS的表达呈强相关性[29]。因此，推测VvMYB30还可能参与了调控果实发育过程中果实和果粉中蜡质的生物合成，其功能有待进一步研究。

4 结论

本研究从‘阳光玫瑰’葡萄中克隆了MYB基因VvMYB30，其表达受盐胁迫诱导。VvMYB30与其他植物的MYB30蛋白同源性较高，为SubgroupⅠ亚家族成员。VvMYB30定位于细胞核且具有转录激活活性。在拟南芥中过表达VvMYB30可显著增强转基因拟南芥的耐盐性。上述结果表明，VvMYB30可能在植物抵御盐胁迫中发挥重要作用。