指纹图谱技术在动物药质量评价中的应用进展

迟东泽，马玉芯，郭 鑫

(1.吉林省药品审核查验中心，长春 130062；2.通化师范学院医药学院，通化 134002)

动物药是指动物整体、器官、生理或病理产物等可供药用的中药材，是中药材的主要来源之一[1]。动物药在我国应用历史悠久，历代本草中都有记载，具有疗效显著、活性强、应用广泛的特点[2]。现代研究表明，动物药与同体积、同重量的植物药相比，大多数都具有极强的生物活性，尤其在治疗顽症、重病方面，更显示出其独特的生理活性。 由于临床需求量增大，药源紧缺，需求旺盛，价格昂贵，动物药材的质量问题，屡有报道，备受公众关注[3]。 因此，药用动物以及动物药的品种鉴定与质量评价工作急需现代技术的介入和支持。 随着现代科技的发展，高效液相色谱、凝胶电泳、高效毛细管电泳、液相质谱联用技术、DNA 分子鉴定技术等方法在动物药的鉴定中起到了重要作用[4]。本研究对动物药的质量现状进行总结，并针对一些指纹图谱技术和方法的应用进行综述。

1 动物药质量评价标准现状

动物药的主要成分多为多糖、蛋白质、核苷等，研究难度较大，导致动物药在应用中品种混乱，其各部分成分与药材的功能主治难以相互对应，质量评价进展缓慢[5]。 因此，亟待结合动物药特点，寻找出符合当前动物药实际应用的质量检测方法与指标，这是解决动物药品质评价问题的关键[6]。

动物药虽然种类少于植物药，但具有一定的药用价值，其特效性强、发展快和前景好等优势，已受到人们广泛的重视和关注[7]。随着人们对动物药深入了解，其市场需求量不断扩大，但大部分动物药材并没有明确的质量评价标准，无法构建完善的质量评价体系[8]。2015 版《中国药典》一部收载动物药材质量评价方法包括液-质联用法鉴别阿胶、龟甲胶、鹿角胶；PCR 法鉴别乌梢蛇和蕲蛇；薄层色谱法检测龟甲、穿山甲、鹿茸、水蛭等重金属和有害元素，地龙等药材中黄曲霉毒素检查等。 2020 版《中国药典》四部附录收载48 种动物药材，仅有药材来源，无具体质量评价和控制项目[9]。

2 动物药质量评价标准方法

2.1 色谱法

2.1.1 薄层色谱法

动物类药材一般市场价格较高，通过简单的色谱方法，可鉴别药材的真伪优劣。 薄层色谱法是根据各成分对同一吸附剂吸附能力不同而将其成分分离出来的一种简单方法，可同时鉴别多种样品，具有简单和快速等特点，是传统的中药材定性、定量的分析方法[10]。张建英等[11]采用薄层色谱鉴别法对珍珠层粉胶囊中氨基酸成分进行研究，该方法斑点清晰、分离度好、专属性强，重现性好，由此建立了珍珠层粉胶囊质量控制的有效方法。 林爽等[12]采用薄层色谱（TLC）法建立指纹图谱和含量测定方法，识别了16 个共有峰，评价不同产地龙血竭药材质量情况。

2.1.2 高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱技术(HPLC) 具有分离度高、重复性好、图谱信息丰富等特点，可用于分析中药有效成分的含量和构建指纹图谱的研究中，是《中国药典》中应用最广泛的中药检测方法之一[13]。 HPLC 已广泛应用于动物药材及其产品的质量评价和控制方面的研究[14]。 曹越等[15]建立10 批鹿茸的HPLC 指纹图谱，利用计算机对鹿茸主成分进行相似度比较，能够对不同产地梅花鹿茸和马鹿茸进行识别。 蔡萍等[16]建立土鳖虫超微粉体中游离氨基酸的HPLC 指纹图谱，采用异硫氰酸苯酯(PITC) 柱前衍生， 梯度洗脱进行色谱分离， 初步建立了土鳖虫超微粉体中游离氨基酸的HPLC 指纹图谱，标定了24 个共有峰，该法分离效果好，灵敏、准确、简单，可作为土鳖虫超微粉体质量评价的方法。

2.1.3 气相色谱法

气相色谱法是利用气体作为流动相的色层分离分析方法。 气化的试样被载气（流动相）带入色谱柱中， 柱中的固定相与试样中各组份分子作用力不同，各组份从色谱柱中流出时间不同，组份彼此分离。 采用适当的鉴别和记录系统，制作标出各组份流出色谱柱的时间和浓度的色谱图[17]。 根据色谱图中表明的出峰时间和顺序，可对化合物进行定性分析；根据峰的高低和面积大小，可对化合物进行定量分析[18]。 具有效能高、灵敏度高、选择性强、分析速度快、应用广泛、操作简便等特点， 适用于易挥发有机化合物的定性、定量分析。 对非挥发性的液体和固体物质，可通过高温裂解，气化后进行分析[19]。吴萍等[20]以此方法测定羚羊角塞注射液和未醇沉液中游离氨基酸的含量，为羚羊角进一步研究提供实验依据。

2.1.4 其他联用技术

各种联用色谱分析技术可对成分复杂的动物药进行结构解析和定性鉴别，适合于缺乏明确对照品的动物药鉴别和质量控制的研究， 如二维液相色谱、高效液相色谱-质谱联用、气相色谱-质谱联用以及新的高效通用检测器如蒸发光散射检测器等分析技术方法[21]。

2.2 光谱法

光谱分析技术在动物药的质量评价中应用广泛，其中包括红外光谱、紫外光谱、原子光谱、质谱、核磁共振光谱以及X 射线衍射光谱等[22]。 金向群等[23]采用红外光谱和紫外光谱分析蟾蜍耳后腺分泌物来区分和鉴别中华大蟾蜍和与其相似的华西大蟾蜍。 此外，红外光谱也可对冬虫夏草、北虫草及其伪品等虫体脂肪量的差异进行比较鉴别[24]。 王丽娟等[25]用粉末X 射线衍射Fourier 谱法对鹿角、 麋鹿角及鹿角伪品牛腿骨进行比较鉴别，结果动物角类药材含有大量无机成分， 利用X 射线衍射可以得到较为尖锐的X 射线衍射峰，根据其几何拓扑图形和特征标记峰值的差异可对各角类药材进行鉴别比较。

2.3 高效毛细管电泳指纹图谱技术

高效毛细管电泳法是近几年兴起的一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术[26]。 毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析乃至单分子分析成为可能，高效毛细管电泳法可用于长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析[27]。 苑广信等[28]通过毛细管电泳的鹿鞭DNA 指纹鉴定方法得出结论， 梅花鹿鞭指纹图谱中有9 个共有峰， 马鹿鞭指纹图谱中有21 个共有峰，与驯鹿鞭、赤鹿鞭有明显差异，而且，其相似度均小于0.7，说明该方法客观、准确、方便，可有效区分梅花鹿鞭、马鹿鞭及其伪品。

2.4 生物指纹图谱技术

中药生物指纹图谱包括作DNA 分子遗传标记的中药材DNA 指纹图谱，以及将色谱分离与分子生物医学二者的成果紧密结合的分子生物色谱指纹图谱[29]。随着分子生物学技术的迅速发展，DNA 分子技术已经越来越多的用于中药材品种鉴别的研究[30]。 史磊[31]通过生物指纹图谱研究发现，采用同一种引物对产地的全蝎样品进行RAPD 扩增， 可以得到多条共同条带，表明其遗传物质基础基本类似。 但山东省内不同产地全蝎样品扩增后所得的条带具有一定的特异性，表明不同产地全蝎DNA 有所变异，RAPD 分子标记作为一种有效的鉴别方法，可以从物种的遗传本质出发，揭示其亲缘关系和遗传背景，对全蝎养殖、品种开发具有重要意义。

3 动物药指纹图谱评价方法

在对动物药指纹图谱进行评价时，只要好好把握指纹图谱整体性和模糊性这两大特征，建立直观而又全面、合理而又简易、精确而又方便的色谱指纹图谱计算机处理方法，就可能对动物药指纹图谱的质量进行合理评价[32]。

3.1 直观分析比较法

将待测样品的图谱与标准图谱进行直接比较，可以鉴定判别药材真伪。但这种方法缺乏量化的数据和统一的标准， 不利于指纹图谱的推广应用及规范化，因其缺点太多近年来已经很少使用[33]。

3.2 化学识别评价模式

3.2.1 聚类分析

聚类分析是用相似度来衡量样品之间的亲疏程度，并以此来实现分类。对于不同批次的药材样品，其色谱指纹图谱经计算机快速辨识处理，可依据样品批与批之间的相似度，确定药材样品批次间的稳定性。色谱指纹图谱常用模糊聚类分析， 它是依据样品的特征、亲疏关系程度和相似性，通过建立模糊相似关系对样品进行分类的方法，能反映样品整体的、主要的特性[34]。 李勇[35]采用聚类分析方法发现成都、大连、黑龙江、南京、北京这5 个产地的水蛭药材聚集紧密，质量相对稳定，能够聚成一类。

3.2.2 主成分分析

主成分分析法是一种应用广泛的多元统计方法，用于简化数据， 快速实现模式或关系的可视化识别。在中药材指纹图谱研究中，一般先选定个别已知化学成分的相对峰面积作为特征值，采用主成分分析求出指标的相关矩阵特征值[36]。 孙伟杰等[37]通过主成分分析方法鉴别并区分4 种鹿茸饮片，以所测定的6 种成分的含量为变量进行主成分分析，由分析结果可知前2 个主成分累积贡献率为92.9%， 其中第1 主成分贡献率为81.1%，第2 主成分贡献率为11.2%。 由初始因子载荷矩阵可知，前2 个成分已基本反映出4 种鹿茸饮片的主要特征。

3.3 相似度评价方法

相似度评价方法最常用的为相关系数法和夹角余弦法。 这两种方法有良好的稳健性和敏感性，即对图谱的细微改变能够反应为数值变化以及对仪器误差能有效克服[38]。 相关系数法是以指纹图谱两组向量的相关系数来反映样品间相似性的一种方法， 适用于同属不同种的药材分析，可以鉴别样品的真伪优劣[39]。夹角余弦法是以两组向量的夹角余弦大小来反映两种样品之间相似性的方法，能够较好地评价指纹图谱间的相似性[40]。 黄玉明等[41]采用相似度评价法将相似度数值0.85 当作区分蛤蟆油药材是否合格的标准，发现11 批优质蛤蟆油药材的相似度在0.866～0.972区间内， 而4 批劣质蛤蟆油药材的相似度在0.560～0.802 区间内，为蛤蟆油的深度开发利用奠定了基础。

4 展望

动物药作为祖国医药宝库中重要的组成部分，在中医临床上有着广泛的应用，随着药理作用方面的开发研究越来越受到重视。 由于动物药具有疗效好、活性强、应用广、潜力大的特点，越来越引起国内外学者的关注和重视。动物药指纹图谱数据库的研究和建立必将成为动物药质量评价的重要发展趋势之一，成为动物药鉴定的重要平台。动物药指纹图谱正处于初步建立的阶段， 其发展的高级阶段是功能指纹图谱，需在中药谱效学基础上，进一步开展研究，采用生物信息学方法把指纹图谱和生物活性、药效等相关的化合物群对应的联系起来，最终建立指纹图谱的综合数据库。 随着科技的进步，动物药的质量控制水平也得到了质的提升，但是进行研究的品种还很少，对其含有的活性成分、药理作用等还没有取得突破性进展。 在加强动物药材基础研究的同时，还需利用现代生物化学分析技术大力开展其质量控制研究，改变动物中药标准相对植物中药严重落后的局面。