3D 生物打印——骨组织再生的新工具

■文/ 张 华 李积宗 冯心宜 孟海华

骨组织再生是一个备受关注的领域，对骨损伤、骨疾病和骨缺陷的治疗具有重要意义。传统的骨组织再生方法受到供体限制、手术风险和功能恢复困难等问题的限制。随着3D 生物打印技术的快速发展，骨组织再生领域迎来了一个全新的前景。

3D 生物打印的主要特点与工作流程

3D生物打印技术是一种创新性的制造技术，结合了3D 打印技术和生物学原理，旨在通过逐层堆叠生物材料来构建具有特定结构和功能的生物组织和器官。与传统的生物制造方法相比，3D生物打印技术具有更高的精度、复杂性和个性化定制能力。传统的3D 打印技术使用塑料或金属等材料打印物体，而3D 生物打印技术则使用生物材料，如细胞、细胞培养基、生物支架等。这些生物材料可以根据特定需求和目标组织的特性进行定制，以制造出模仿自然组织特征的生物医学部件。

3D 生物打印技术的工作流程一般包括以下4 个步骤。一是设计模型。使用计算机辅助设计（CAD）软件创建目标组织或器官的三维模型，这个模型可以根据需要进行个性化定制，以适应不同患者的需求。二是准备生物墨水。根据目标组织的类型和特性，制备适当的生物墨水。生物墨水通常由生物材料（如细胞）和生物支架（提供结构支持）组成。三是打印过程。将生物墨水加载到3D 打印机中，并按照预定的CAD 模型进行打印。打印机按照逐层堆叠的方式，将生物墨水逐渐转化为具有特定结构和功能的生物组织。四是细胞培养和成熟。打印完成后，生物组织需要进行细胞培养和成熟的过程。在适宜的培养条件下，细胞将自行分化和生长，形成完整的组织结构。

3D 生物打印的先进材料

墨水材料的选择是生物打印成功与否的关键。在骨科组织的生物打印中，选择合适的墨水材料可以确保打印出具有所需力学性能和生物相容性的组织结构。常用的墨水材料包括合成聚合物、水凝胶基等。在组织打印过程中应考虑其流变性、机械性能、仿生性、生物降解性等关键特性。

●合成聚合物作为生物墨水

合成聚合物作为生物墨水在生物打印中具有广泛的应用。合成聚合物的选择应考虑其生物相容性、可加工性、力学性能和生物降解性等关键特性。常见的合成聚合物包括聚乳酸（PLA）、聚乙二醇（PEG）、聚己内酯（PCL）等。这些聚合物具有良好的生物相容性和生物降解性，可用于打印组织工程支架和修复材料。此外，还有一些具有特殊功能的合成聚合物，如温敏聚合物、光敏聚合物和电活性聚合物，可用于实现具有响应性和智能性的生物打印，通过选择合适的合成聚合物，可以实现精确控制的组织构建和功能性生物材料的制备。

●水凝胶作为生物墨水

水凝胶生物墨水是一种重要的生物打印材料，它能够在生物打印过程中提供支撑和保护细胞，并为细胞提供适宜的生长环境。水凝胶是由水和高分子聚合物交联形成的3D 网络结构，具有优异的生物相容性和可调控的物理性质，因此被广泛应用于组织工程、药物输送系统、生物传感器和仿生材料等领域。一些常见的天然来源水凝胶有海藻酸盐、明胶、胶原蛋白、脱细胞基质（dECM）等。

dECM 生物墨水的生物相容性和生物活性使其成为组织工程和再生医学领域中的重要材料。它由去细胞化的细胞外基质制成，通常来自动物组织，如心脏、肝脏等，可以用于制备具有生物活性和生物相容性的复杂生物医学结构，为组织工程、再生医学和个体化医疗领域提供了重要的解决方案。

3D 生物打印在骨组织工程中的应用

肌肉骨骼系统由多种组织组成（如骨骼、软骨、骨骼肌、肌腱/韧带和其他组织组成），它们结合在一起同步工作，为身体提供支撑和稳定性并保护重要器官。骨科手术常用于治疗肌肉骨骼创伤、损伤和退行性疾病。在许多病理性疾病中，移植术是恢复组织功能最可行的选择之一。目前，自体移植物仍然是骨科临床的金标准。然而，它们的局限性如资源有限、供体部位的移动性、疾病传播和功能丧失等，可能会限制其临床使用。由于组成、组织和机械行为的复杂性，寻找具有合适的生物材料和生物制造方法的理想植入体，以实现最佳的再生结果是具有挑战性的。因此，3D 生物打印技术引起了人们的广泛关注，并成为推进再生医学发展的重要工具。

基于3D 生物打印的生物制造为3D 功能组织等价物的生产开辟了新的途径，以鼓励受损组织的再生，如骨骼、软骨、骨骼肌、肌腱/韧带及其相关的多组织界面。

●3D 生物打印在骨组织方面的应用

由于老化、创伤、肿瘤、感染和关节置换术失败而引起的骨丢失和损伤通常需要手术干预，以协助骨缺损和骨折的愈合。在临床治疗方案中，自体移植是目前修复骨病变的金标准，但往往由于缺乏替代品而受到限制，还面临供体部位发病率高和可能的病原体传播等问题。3D 生物打印是生产骨组织工程定制支架的一个有吸引力的策略。许多研究已经探索了3D 生物打印在工程再生生物支架中的潜力，这项技术允许以一种逐层堆叠的方式创建复杂的生物组织和结构，从而为组织工程和再生医学领域提供新的可能。大多数3D 打印支架将生物陶瓷，如羟基磷灰石（HA）和β-磷酸三钙（β-TCP），结合到合成材料中，以提高其骨导电性和成骨能力。例如，2016 年美国西北大学的拉米列·沙阿（Ramille Shah）和阿达姆·亚库斯（Adam Jakus）首次开发了一种超弹性骨（HB）墨水用来打印一种用于骨再生的弹性结构，目标是开发一种能够模拟人体骨骼的高度弹性结构，以提供更好的骨组织再生支持。传统的骨组织工程材料往往过于脆弱，无法承受骨骼的动态负荷，而HB 墨水通过其独特的超弹性弥补了这一缺陷。

随着3D 生物打印技术的发展，目前的研究主要集中在3D 生物打印结构中复制细胞外基质（ECM）和矿化骨环境。ECM 是一种复杂的三维支架结构，存在于细胞周围，对细胞的生长、分化和功能发挥起重要作用。研究人员利用3D 生物打印技术，可以精确控制打印材料的排列和组织结构，以复制ECM 的特征。骨组织的矿化过程对骨骼的形成和维持至关重要。通过3D 生物打印技术，研究人员可以打印出类似骨骼中矿化环境的结构。例如，利用打印材料中含有钙磷化合物，可以模拟骨骼中的矿化成分。这种方法可以为骨组织工程提供更逼真的仿生构建物，提供骨细胞生长和骨矿化所需要的适宜环境。此外，通过控制打印材料的成分和结构，还可以调节构建物的机械性能，使其更接近自然骨骼的力学特性。

目前，在生产具有临床相关性和功能性的骨替代品方面还存在许多挑战，包括生物相容性和生物降解性、结构和功能仿真、细胞源和细胞培养、血管化和供血、临床验证和监管要求等。3D 生物打印骨组织的临床转化在被广泛使用之前需要克服这些关键障碍。

●3D 生物打印在软骨组织方面的应用

软骨组织可分为透明软骨、弹性软骨或纤维软骨，它们根据给定的软骨组织的特化来执行不同的功能。软骨是一种缺乏血管和神经的结缔组织，主要由被称为软骨细胞的特化细胞组成。由于缺乏血液供应，软骨的新陈代谢和细胞更新速度较慢，细胞数量也相对较少。这导致了软骨组织的自我修复和再生能力较弱。因此，局灶性软骨病变很少愈合，通常会导致关节结构和功能的进行性和退行性改变。目前的手术治疗效果有限，导致受伤部位的严重疼痛和活动能力受损。3D 生物打印技术在软组织工程中的应用正在不断发展。虽然软组织与硬组织（如骨骼）相比具有不同的特性，但3D 生物打印提供了一种潜在的方法来构建和修复软组织。

结合合成生物材料墨水和含细胞水凝胶生物墨水对混合结构的3D 生物打印已成为一种流行的再生方法，以提高软骨组织工程结构的生物力学和生物性能。美国伊利诺伊理工学院生物医学工程系副教授福尔格尼·帕蒂（Falguni Pati）等利用3D 生物打印技术开发了一种混合细胞负载结构，使用PCL 和dECM 生物墨水交替打印，形成一种多层结构。PCL 提供了结构支持和机械强度，而dECM 生物墨水则包含软骨细胞所需的细胞信号分子和细胞黏附位点。通过这种方法，研究人员成功地构建了一个PCL 层和dECM 层交替排列的混合细胞负载的结构。这种结构能够为软骨细胞提供合适的生长环境，并促进软骨组织的再生和修复。该研究展示了在3D生物打印中利用不同材料的交替层构建复杂的混合细胞负载结构的潜力。通过调控材料的组合和层次结构，为不同类型的细胞提供适当的支持和信号，从而更好地模拟和促进软骨组织的生长和再生。2019 年，上海交通大学医学院附属第九人民医院周广东教授和东华大学莫秀梅教授在《材料与设计》（Materials&Design）杂志上共同发表一篇题目为《用于软骨再生的三维打印电纺纤维支架》（Three-dimensional printed electrospun fiber-based scaffold for cartilage regeneration）的文章。研究人员将静电纺丝、3D 打印、冷冻干燥、交联等技术相结合，成功地将静电纺丝纤维制成了外观形状准确、大孔结构可控、力学性能良好的三维纤维支架。

总的来说，3D 生物打印技术通过将细胞、生物材料和/或生物活性蛋白等生物成分结合在一起，可以实现仿生构建的软骨组织工程。然而，使用3D 生物打印技术的软骨修复并没有在临床实践中使用。生物打印组织在软骨再生临床转化中面临的挑战包括细胞源和质量控制、生物墨水开发、结构复杂性、血管化和生物材料降解、安全性和效果评估等。通过不断的研究和技术进步，3D 生物打印技术有望克服这些障碍，为软骨再生提供更有效的治疗手段。

●3D 生物打印在骨骼肌组织方面的应用

骨骼肌在维持其结构和促进运动中起着核心作用。骨骼肌具有复杂的结构和功能，包括肌纤维、肌束、肌肉腹、肌腱等组织。传统的组织工程方法往往难以准确地重建这些结构，并且无法满足骨骼肌再生和修复的需求。3D 生物打印技术可以通过将细胞、生物材料和生长因子等生物成分精确定位和分层堆叠，实现精细控制组织构建。

与其他骨科组织（如骨、软骨、肌腱或韧带）不同，骨骼肌是一种相对软的组织。因此，聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）、胶原蛋白、明胶、海藻酸盐、纤维蛋白和肌肉来源的dECM等水凝胶材料，由于其柔软性和生物相容性，被广泛应用于生物打印肌肉结构。

通过将神经细胞与生物打印的骨骼肌构建整合，研究人员能够模拟正常肌肉的神经连接。这种神经输入为肌肉结构的再生提供了额外的刺激和指导，有助于促进其恢复和重建。在实验中，将细胞和生物打印材料相结合，通过合适的生长环境和条件，细胞能够成长和发育。通过模拟神经输入，这些细胞可以在构建的肌肉结构中形成新的神经连接，并与周围的组织相互作用。生物打印的骨骼肌结构中的神经输入对结构和功能的恢复起到了关键作用。这种细胞和神经整合的方法有望帮助人体肌肉损伤的治疗和恢复。

●3D 生物打印在肌腱/韧带及其界面组织方面的应用

肌腱和韧带是人体中的重要结缔组织，对维持关节的稳定性和促进肌肉骨骼组织之间的平滑负荷传递起着关键作用。3D 生物打印技术在肌腱/韧带及其界面组织工程中具有广泛的应用前景，包括生物材料打印、结构支架打印、生物打印细胞等。

一是生物材料打印。传统的组织工程材料往往难以满足复杂的组织结构和功能需求，而生物材料打印提供了一种定制化制备的解决方案。例如，可以被精确地定位和排列生物可降解聚合物、生物陶瓷和生物纤维素等材料可以根据需要进行选择，以满足不同肌腱/韧带组织的特性和性能要求。这些材料在3D生物打印过程中，可以构建具有类似自然组织结构的肌腱/韧带工程。

二是结构支架打印。3D 生物打印技术可以制造肌腱/ 韧带的支架结构，为细胞提供生长和扩散的空间，同时也提供力学支持。支架的孔隙结构也是一个关键因素。3D 生物打印技术可以设计出具有特定孔隙率和大小的支架结构，以促进细胞迁移、营养输送和新生组织形成。此外，支架材料的力学性能也可以根据需要进行调整，以提供适当的刚度和弹性。

三是生物打印细胞和因子。3D 生物打印技术可以精确地定位细胞和生物因子，以促进肌腱/韧带组织的再生和修复。例如，通过打印预定位置的细胞，可以模拟自然组织中的细胞排列和分布，促进组织的完整修复。

总的来说，目前3D 生物打印技术在骨组织工程中的应用已经取得了显著的进展，并展示出巨大的潜力。未来，通过与合成生物学、基因编辑等其他前沿技术相结合，3D 生物打印技术在骨组织工程领域的应用将实现进一步的突破和创新，为临床实践带来更大的益处。