双生病毒AC4基因的克隆及原核表达

郝浩永,王 红,刘 缙,关正君,李文清,杨先先

(1.运城学院 理科实验中心;2.运城学院 生命科学系,山西 运城 044000)

双生病毒是在世界范围内广泛存在的一类植物病毒[1],可侵染多种作物引起严重的病害,造成重大的经济损失,并经常危及粮食安全[2,3]。双生病毒具有小的单组份(DNA-A)或双组份(DNA-A和DNA-B)单链环状基因组DNA (约2.5～5.2 nt),编码4～8个基因。

在双生病毒科14个属中,有4个属,即甜菜曲顶病毒属(Curtovirus) (3种)、番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus) (1种)、芜菁曲顶病毒属(Turncurtovirus) (3种)和菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus) (>420种)均含有一个小基因AC4,该基因完全叠加在AC1基因中[4]。双组份双生病毒DNA-A上的C4基因被称为AC4基因,单组份双生病毒DNA-A上的C4基因被称为C4基因或AC4基因,对其他基因的称谓类似[4]。AC1基因在整个双生病毒科的基因组位置和功能上是保守的[4]。AC4基因覆盖在AC1基因靠近5′端的部分,AC4的密码子相对于AC1的密码子向后移动1个碱基,即+1位移码[5-7]。AC4可能起源于AC1内的重叠机制,基因重叠允许病毒增加编码能力,随后增加遗传变异,同时保持小而紧凑的基因组。这可以解释AC4基因功能变异,并有助于双生病毒多样化和宿主跳跃。AC4基因相当大的变异不仅表现在序列上,而且也表现在其编码的蛋白质长度上(58～140 aa);有趣的是,一些氨基酸残基是保守的[8]。

在系统发育上,Begomovirus病毒的基因中AC4基因最易变异[8]。虽然AC4基因在少数Begomovirus中不发挥作用[9,10],但在大多数Begomovirus中具有多种生物学功能,例如病毒运动[11]、 RNA沉默的抑制[12-14]、症状诱导[15]、促进过敏反应[16]、诱导增生[17-19]、增加病毒积累[19]、提高耐旱性[20]、维持β卫星分子(betasatellite)的存在[21],以及增强番茄对白粉病的抗性[22]等。AC4基因还表现出与人类病毒“致癌基因”相似的功能[23, 24]。

有文献[25]报道,中国番茄黄化曲叶病毒TYLCCNV-Y10分离物编码的AC4蛋白和烟草曲茎病毒TbCSV-Y35分离物的AC4蛋白都是RNA沉默抑制子, 而 Y35 AC4 蛋白是一个比 Y10 AC4 蛋白更强的抑制子,推测 TbCSV-Y35 和 TYLCCNV-Y10 致病性差异可能与二者AC4蛋白的功能差异有关。

通常双生病毒IR区的变异最大[26-29]。我们在前期研究中[30],将Begomovirus病毒分离物SXYC-X4(GenBank登录号:KY499720)与其他25种病毒分离物的DNA-A及ORFs的序列比对,发现AC4蛋白氨基酸序列变异(32.9%～97.9%)大于IR区(61.5%～99.7%)及其他ORFs氨基酸序列的变异。在系统发育上,SXYC-X4与TbCSV-India(KF551584)的进化关系在DNA-A全序列水平较远,在IR区水平稍近,在AC4氨基酸序列水平最近。由此推测,自然界中番茄黄化曲叶病毒(TomatoYellowLeafCurlVirus,TYLCV)与烟草曲茎病毒(TobaccoCurlyShootVirus,TbCSV)在AC4基因处可能已经发生了广泛的重组,TYLCV有可能会获得更强的致病性。

SXYC-X4AC4基因预期编码一个约10 KD的蛋白质,其功能目前尚不明确。我们克隆了AC4基因,构建了AC4基因的原核表达载体,进一步优化了诱导表达条件,研究结果为下一步大量制备并分离纯化AC4蛋白、制备抗血清及研究SXYC-X4AC4基因的功能奠定基础,同时对解析双生病毒的致病机制及开发绿色防控技术也具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

确认已感染双生病毒科菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的番茄病株,于2016年8月采自运城学院新校区,主要症状为新叶黄化、卷曲,节间缩短等[30]。参照文献[31],提取病株叶片基因组DNA作为病毒毒源,-20℃保存。以健康番茄叶片作为对照材料。

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3),原核表达载体pGEX-4T-1为运城学院分子生物学实验室保存;DNA Marker为合肥博美生物有限公司产品;克隆载体pGM-T为北京天根生物公司产品;蛋白质Marker、EX Taq、限制性内切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ为TaKaRa公司产品;T4 DNA Ligase为GenView公司产品;引物合成委托生工生物工程(上海)有限公司完成;其余药品为国产分析纯。

1.2 AC4基因的克隆

根据TYLCV分离物SXYC-X4(GenBank登录号:KY499720)序列,合成一对特异性引物TYAC4-F(5’-GAATTCACGAGAATGGGGAAC-3’,方框中ATG为起始密码子,下划线处为EcoR I酶切位点,)和TYAC4-R(5’-GTCGACTATAGTCCTTTGGGG-3’,与AC4基因终止密码子下游10～25 bp处互补,下划线处为Sal I酶切位点)。以番茄病株基因组DNA为模板,利用EX Taq对AC4基因进行PCR扩增,用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应体系为:模板1 μL,EX Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1 μL,10×Buffer 5 μL,上下游引物(10 μM)各1 μL,dNTP Mixture(2.5 μM Each)10 μL,加入ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件为:94℃ 5 min;94℃ 60 s,47℃ 45 s,72℃ 45 s,35个循环;72℃ 5 min。

PCR产物经切胶回收、纯化后,依说明书连接至克隆载体pGM-T,转化大肠杆菌DH5α,在LB固体培养基(含100 μg/L氨苄西林)上37℃培养12—16h进行蓝白斑筛选,挑取白色单克隆菌落培养,碱裂解法提取质粒DNA,经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切鉴定重组质粒正确后,由生工生物工程(上海)有限公司进行测序。克隆成功的载体命名为pGM-AC4。

1.3 原核表达载体的构建

将重组克隆载体pGM-AC4与pGEX-4T-1分别用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,回收目的片段后用T4 DNA Ligase进行连接并转化DH5α,挑取部分单克隆培养,用测序引物GEX5(5’-GCAAGCCACGTTTGGTG-3’)和GEX3(5’- GAGCTGCATGTGTCAGAGG -3’) 做菌液PCR筛选阳性重组子。PCR反应体系同1.2。PCR反应条件为:94℃ 5 min;94℃ 60 s,50℃ 45 s,72℃ 45 s,35个循环;72℃ 5 min。将菌液PCR筛选为阳性重组质粒送生工生物工程(上海)有限公司进行测序,分析是否有移码突变。序列正确的重组表达载体命名为pGEX-4T-AC4。

1.4 诱导表达

利用热激法,将重组表达载体pGEX-4T-AC4转化BL21(DE3)并进行涂板培养,挑取单菌落接种到LB液体培养基中(含100 μg/L氨苄西林),37 ℃振荡培养至OD600nm≈0.6,加入IPTG至终浓度为0.50 mol/L,于28 ℃下诱导4 h(200 rpm),取1 mL菌液加入1.5 mL EP管中,离心1 min(12000 rpm),弃上清,重复三次,富集菌体。用200 μL灭菌蒸馏水重悬,再加入200 μL 2×SDS凝胶上样缓冲液,沸水中裂解5 min,温度降至室温后,12000 rpm离心5 min,上清液立即进行SDS-PAGE,检测GST-AC4可溶性融合蛋白,或-20℃保存备用。含pGEX-4T-1的BL21(DE3)菌液作为对照做相同处理。

1.5 诱导条件的优化

为获得最佳的诱导条件,分别对IPTG诱导浓度、诱导时间及诱导温度进行优化,使用SDS-PAGE检测。

IPTG诱导浓度优化。细菌培养及处理方法同1.4,IPTG终浓度梯度设为0、0.10、0.25、0.50、1.0、2.0 mmol/L,28℃振荡培养4 h(200 rpm)。

诱导时间优化。细菌培养及处理方法同1.4,时间梯度设为0、2、3、4、5、6 h,IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L,28℃振荡培养(200 rpm)。

诱导温度优化。细菌培养及处理方法同1.4,温度梯度设为25℃、28℃、32℃、35℃、37℃,IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L,200 rpm振荡培养4 h。

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果

以病株样品和健康番茄基因组DNA为模板,利用引物TYAC4-F和TYAC4-R进行PCR扩增,从病株中扩增出大小约为330 bp的条带,与预期大小一致,而健康植株中未扩增出,初步确认扩增出的条带为番茄黄化曲叶病毒AC4基因(图1)。

M:DNA marker; 1—2:健康番茄样品; 3:感病番茄样品。图1 用引物TYAC4-F和TYAC4-R进行PCR扩增的结果

2.2 AC4基因测序结果

经测序,克隆到的AC4基因长294 bp,重组克隆载体暂命名为pGM-AC4。通过BLAST比对分析,克隆到的AC4基因与番茄黄化曲叶病毒分离物SXYC-X4的AC4基因序列完全一致。

2.3 AC4基因原核表达载体的构建及检测

经菌液PCR检测,部分重组原核表达载体能扩增出大小约为500 bp的条带,而空载体仅能扩增出约170 bp的条带,与预期大小一致(图2),表明AC4基因片段已插入到载体pGEX-4T-1。重组成功的原核表达载体暂命名为pGEX-4T-AC4。经测序比对,pGEX-4T-AC4的序列未发生变异,读码框正确,可以进行下一步的诱导表达。

2.4 pGEX-4T-AC4的诱导表达

采用热激法,将pGEX-4T-AC4和空载体pGEX-4T-1分别转化大肠杆菌BL21(DE3)。经0.50 mol/L的IPTG在28℃下诱导培养4 h(200 rpm),SDS-PAGE检测发现,pGEX-4T-AC4表达出大小约为36 KD的蛋白,与预测大小一致,未经过诱导的样品则没有该蛋白,含pGEX-4T-1的菌株在诱导后出现大小约为26 KD的蛋白。BL21(DE3)空菌株经IPTG诱导前后无明显差异,说明pGEX-4T-AC4成功表达GST-AC4融合蛋白(图3)。

2.5 最优诱导条件的筛选

菌体经过0.10～2.0 mmol/L IPTG诱导后均有目的蛋白表达,未经IPTG诱导的菌体几乎无目的蛋白表达(图4)。通过Tanon Image凝胶分析软件测定(下同),随着IPTG浓度的增加,GST-AC4融合蛋白的表达量呈先增加后稳定的趋势。当IPTG浓度为0.50 mmol/L时,该蛋白表达量最高,继续增加IPTG浓度后GST-AC4表达量基本不再增加。从经济角度考虑,0.50 mmol/L是IPTG的最佳诱导浓度。

加入0.50 mmol/L IPTG后诱导不同时间的重组载体表达结果如图5所示,经过2 h、3 h、4 h、5 h、6 h诱导后的菌体均有目的蛋白表达。通过凝胶分析软件测定,结果显示,随着诱导时间的增加,GST-AC4融合蛋白的表达量呈先增加后降低的趋势。当诱导时间为3 h时,该蛋白表达量最高,继续增加诱导时间后表达量逐步降低,即诱导3 h是最佳诱导时间。

M:Premixed Protein Marker(Broad);1—6:诱导时间分别为0 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。图5 不同诱导时间对GST-AC4融合蛋白表达的影响

加入0.50 mmol/L 的IPTG后在不同温度下诱导GST-AC4融合蛋白表达结果如图6所示,分别在25℃、28℃、32℃、35℃、37℃下诱导3 h后的菌体均有目的蛋白表达。通过凝胶分析软件测定,结果显示,随着诱导温度的增加, GST-AC4融合蛋白的表达量呈先增加后降低的趋势。当诱导温度为32℃时,该蛋白表达量最高,继续提高诱导温度后表达量逐步降低,即32℃为最佳诱导温度。

3 结果与讨论

病毒的非结构蛋白在寄主体内的含量通常很低,一般很难从寄主体内提纯这些蛋白。本文利用基因工程手段,克隆了双生病毒非结构蛋白基因AC4,构建了原核表达载体,在BL21(DE3)菌株中成功表达了GST-AC4融合蛋白,进一步优化了诱导表达条件, 为大量制备AC4蛋白及研究AC4功能奠定基础。

前期研究中[30],我们是分段扩增病毒DNA-A片段并将PCR产物直接测序的,本实验只能以病株总DNA为模板扩增AC4基因,重复性不太好,非特异性片段也经常出现,增加了工作难度。在后期优化诱导表达条件时(图4、图5、图6),效果不如最初(图3),再重复优化前的实验时,效果仍不理想,需进一步查找原因并改进。

本实验使用原核表达载体pGEX-4T-1表达的GST-AC4融合蛋白,其活性还需进一步研究。下一步计划构建AC4基因的真核表达载体,在毕赤酵母中表达AC4蛋白,比较在不同体系中表达的蛋白的差异。