富血小板血浆在椎间盘退变治疗中的应用

田志康 综述 孟纯阳 审校

(1济宁医学院临床医学院,济宁 272013;2济宁医学院附属医院脊柱外科,济宁 272029)

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)造成的颈肩腰腿痛全球发病率超过80%[1]。作为人体内最大的无血管组织,椎间盘由中央髓核(nucleus pulposus,NP)、外纤维环和软骨终板3部分组成。包括过度机械负荷、生物因素、细胞营养的变化和炎症微环境在内的多种因素均可诱发IDD[2]。值得注意的是,退变椎间盘内的炎症可以驱动细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解、生长因子活性及合成代谢速率降低,从而导致椎间盘保水和承重能力下降,引起椎间盘突出,压迫脊神经诱发颈肩腰腿痛[3]。

当前IDD的治疗主要包括保守治疗和手术治疗,其中保守治疗以缓解疼痛为主要目的,包括休息、物理和药物治疗方法。手术治疗则是通过消除脊柱节段间的运动来减少椎间盘源性疼痛。寻找一种行之有效的无创非手术疗法已成为当前的难点和热点。随着生物治疗技术的快速发展,使用自体细胞疗法治疗IDD的病例日益增加,其中最具代表性的是富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)和含有间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的骨髓浓缩物。

1 PRP分类与制备

PRP是众多生物疗法中一项很有前景的新技术,它是由自体全血离心得到的,包含许多从血小板α-颗粒和致密颗粒中释放的生物活性介质,还有一些来自血浆的成分,如凝血酶原、纤维蛋白原、纤维连接蛋白等。PRP的生物学功能表现在与活化的血小板表达的黏附蛋白一起参与组织损伤识别和受损组织修复,并在细胞信号通路中发挥核心作用[4]。由于其极具潜力的再生作用,已成为骨科急慢性疾病的一种有前途的治疗工具[5-6]。此外,PRP不仅对髓核细胞(Nucleus pulposus cells,NPCs)有促增殖、促分化、抗凋亡的作用,而且可以通过诱导ECM的合成和分泌来调控细胞外微环境。PRP应用于IDD有以下优点:1)不发生免疫排斥反应;2)可以避免疾病的传播;3)可以通过离心制备,且比重组生长因子价格低。然而,由于其制备标准不统一,不同的制备方法可能导致细胞和细胞因子在PRP中的浓度不同[7-8],给研究PRP带来了巨大的挑战。

根据白细胞和纤维蛋白含量不同,PRP主要分为4类:纯富血小板血浆(pure platelet-rich plasma,P-PRP)、白细胞富血小板血浆(leukocyte-containing platelet-rich plasma,L-PRP)、富白细胞血小板纤维蛋白和纯富血小板纤维蛋白。不同类型的PRP因其物质成分的含量不同,对IDD的修复作用也不同[8]。众所周知,白细胞的数量上升会增加TNF-α、IL-1β等炎症相关因子的表达。尽管P-PRP和L-PRP均能诱导正常髓核间充质干细胞(N-NPMSCs)的增殖和分化,上调ECM相关蛋白的表达。但是L-PRP中的白细胞会激活NF-κB通路,上调椎间盘细胞的分解代谢细胞因子MMP-1和MMP-13,增强椎间盘细胞的分解代谢,抵消血小板释放的生长因子的抗炎作用,对IDD的修复产生不利影响[9]。此外,L-PRP中的白细胞可以激活退变的髓核间充质干细胞(D-NPMSCs)的炎症反应和分解代谢[10],抑制NPMSCs的增殖和分化,从而减缓其对退变椎间盘的修复作用。与N-NPMSCs相比,D-NPMSCs形成的集落更少,增殖更慢,PRP中的白细胞成分降低了PRP的促增殖作用,因此,P-PRP或许是更适合的早期IDD治疗策略。目前制备PRP没有明确的标准,不同方法得到的PRP中生物活性成分含量和疗效存在显著差异[11]。有研究比较了手工制备一次离心法及OSP套装制备二次离心法制备的PRP对IDD修复作用的影响[12]。结果显示,相对于手工制备方式,以OSP为代表的套装制备法所得PRP的白细胞浓度和血小板富集倍数均高于手工组。同时套装制备组对退变椎间盘有更明显的细胞增殖作用,可以更好地促进胶原蛋白Ⅱ(collagen type Ⅱ,COLⅡ)的合成。然而,套装制备组的白细胞浓度也较高,其产生的促炎因子能够促进蛋白聚糖(aggrecan,AGC)的去硫酰化并诱发其降解,抑制细胞外基质的合成,降低疗效。因此,有必要进一步明确PRP的制备标准以及各组分对退变椎间盘的精确作用,并分离出白细胞等不利于IDD修复的成分,使其在临床发挥更佳的作用。

2 PRP在IDD修复中的研究

2.1 体外研究

PRP中有丰富的生长因子,其中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的浓度最高,其不仅可以促进ECM的合成,同时还可以参与免疫调节、损伤修复等多种生理过程[13-14]。经PRP处理后,NPCs中TGF-β1的浓度明显升高,同时PRP可以有效提高COLⅡ、AGC、sox-9 mRNA的表达水平,以及Smad2/3、COLⅡ、AGC的蛋白表达。用TGF-β1抑制剂抑制TGF-β1受体的激活,可降低Smad2/3、COLⅡ和AGC的表达[15]。这表明,PRP通过髓核细胞的TGF-β1受体激活TGF-β1/Smad2/3通路,增加ECM成分的合成分泌,发挥IDD治疗作用。

P-PRP来源的外泌体(platelet-rich plasma exosomes,PRP-exo)是PRP释放的含有高浓度生长因子的微粒,能消除NPCs中H2O2诱导产生的活性氧,并抑制NPCs促炎细胞因子(IL-1β、IL-18、TGF-β和IL-6)的生成和分泌[16]。同时,PRP-exo可以通过下调Keap1来促进Keap-Nrf2复合物释放Nrf2,并使Nrf2从细胞质转移到细胞核发挥其抗氧化作用,抑制氧化应激介导的细胞焦变性,从而减轻IDD。此外PRP-exo通过调控NF-κB和MAPK通路来抑制M1巨噬细胞的极化,促进STAT6磷酸化影响M2巨噬细胞的极化,增加NLRP3泛素化和减少IL-1β和Caspase-1的产生促进NLRP3的自噬降解。同时,PRP-exo还可减少IL-1β诱导的NPCs凋亡[17]。PRP-exo对IDD的治疗作用显示了PRP在IDD非细胞疗法中的巨大潜力。

这都充分验证了PRP在促进NPCs增殖、分化、抗炎、抗氧化等方面具有重要作用。尽管如此,对PRP-exo的相关研究还很有限。将来的研究可以向分离PRP中的有效成分(如外泌体、TGF-β1等)来修复退变的椎间盘靠拢。同时,PRP对细胞增殖的积极作用不与PRP的浓度呈正相关,高浓度的PRP也可能抑制细胞增殖,而低浓度的PRP可能对细胞增殖有长期的积极影响[15]。

2.2 体内研究

PRP的体内实验不仅可以模拟临床环境的修复过程,还可以发挥其作为一种自体动态、海绵状纤维蛋白基质支架的真正治疗潜力,为临床应用奠定基础。

与体外研究得出的结论一致,由于PRP中TGF-β含量较高,可以激活TGF-β/Smad 2/3途径,促进COLⅡ和其他基质成分的合成和分泌,从而延缓IDD[15]。含有PRP的水凝胶能有效修复大鼠的退变椎间盘[18]。PRP发挥修复作用的前提是被凝血酶等激活物激活,从而将其含有的各种生长因子释放出来。然而激活后的PRP会立即转变为凝胶状,不利于注射。这为PRP的研究带来了新的挑战,先前的研究从激活的PRP中提取出呈现液态、可用于椎间盘注射的富血小板血浆释放物(platelet-rich plasma releasate,PRPr),注射入退变椎间盘后,椎间盘高度、组织学形态、细胞数量、ECM含量均得到明显改善,并且PRPr治疗后椎间盘内的AGC和COLⅡ含量升高[19]。提高PRP中血小板含量将有助于获取更高活性的PRPr,这为PRP治疗IDD提供了新的方向。

细胞治疗IDD的局限性之一是由于IDD的恶劣微环境限制了MSCs的生存和分化能力[20],而PRP却可以通过诱导ECM合成和分泌来调控细胞外微环境[21]。

最近,有研究将PRP作为水凝胶成分,构成负载MSCs的载体,用来修复退变的椎间盘。结果显示含有PRP的水凝胶不仅可以维持椎间盘结构的完整性,同时可以增强MSCs的增殖活力及抗氧化能力[22-23]。

含有PRP的水凝胶与骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞联合注射到退化的动物椎间盘中发现MSCs在体内移植后能存活12周,远超过单纯注射MSCs[24-25]。这是由于注入椎间盘的PRP可以被周围组织激活,与MSCs形成三维支架,维持MSCs的增殖与活力,保持其持续的再生作用。以上这些研究表明,PRP与MSCs的联合治疗或许是治疗IDD的更好方式,然而最佳的PRP和MSCs的移植方法和治疗比例仍不明确,希望将来可以制定出与MSCs联合使用的最佳比例。且PRP通过哪种方式来调控MSCs的增殖分化能力及抗氧化还有待进一步探讨。

3 PRP在IDD修复中的临床应用

体外实验和体内实验都已证明PRP对退变椎间盘的治疗作用,接下来需要在临床试验中进一步验证。一项对47例慢性腰椎间盘源性疼痛患者的前瞻性、双盲、随机对照研究表明[26],与对照组相比,椎间盘内注射PRP在功能[功能评分指数(Functional Rating Index,FRI)、疼痛(数值评分量表(Numeric Rating Scale,NRS)]和患者满意度方面有统计学意义的改善。经过一年的随访,NRS、FRI和SF-36疼痛评分从基线到6个月再到1年得到持续显著的改善。两年以后PRP注射液治疗对疼痛和功能的改善仍旧具有统计学意义,并且注射PRP没有显示出不良事件[27]。Cheng等[28]将随访时间再次延长至5～9年,结果显示这部分患者在注射治疗5～9年同样表现出统计学上和临床上显著的疼痛和功能改善。一系列临床随访充分说明PRP采取椎间盘注射法治疗IDD是可取的并且具有长期疗效。此外,有研究评估了在透视引导下硬膜外椎板间注射5mLPRP治疗慢性IDD相关下腰痛患者的临床疗效。在为期3个月的研究中,患者症状逐渐持续改善,VAS评分和改良Oswestry残疾问卷评分均有所改善。值得注意的是,经硬膜外注射的PRP可直接进入病变神经根区域,同样没有产生不良反应[29]。鉴于该试验随访时间较短,仍需进一步的研究来探明经硬膜外椎板间注射PRP的长期有效性及安全性。

在有限的研究中我们可以发现,不论是在椎间盘内注射PRP还是通过硬膜外椎间板注射PRP,对退行性椎间盘的治疗都有作用,且没有不良事件发生。希望将来可以有更多的临床资料来优化PRP治疗策略,更好地服务于临床IDD的修复。

4 总结与展望

IDD是一种慢性退行性疾病,其特点是NPCs数量减少,ECM降解,促炎因子水平升高。PRP作为生物治疗IDD的重要组成部分,其所含有的各种生长因子不仅发挥促进NPCs增殖、ECM合成、抑制炎症反应、改善退变椎间盘的微环境的作用。而且PRP不会造成免疫排斥反应和疾病的传播,还可以通过离心制备。经PRP改善后的微环境更加适合MSCs的生存,此外,PRP与MSCs在IDD的联合使用,为IDD的修复提供了一个全新的、可行的策略。

然而,PRP的制备标准一直未能得到统一,不同方法得到的PRP中生物活性成分含量存在显著差异,且对于能够引发最优作用效果的PRP的确切体积分数尚无明确定论。目前已明确修复作用机制的生长因子是TGF-β1,其他生长因子的作用机制还有待进一步研究。值得注意的是随着年龄的增长,PRP依赖其生长因子对IDD的修复作用会因细胞膜上生长因子的受体的减少而变差,所以PRP主要作为一种早期预防椎间盘进一步退变的治疗方式。随着生物治疗成为研究热点,PRP与MSCs的联合应用或许可以结合两种治疗的优点,成为新的研究方向。

利益冲突:所有作者均申明不存在利益冲突。