生物光学成像技术在组织穿透性方面的研究进展

张玉敏，王 富，林 俐，叶 坚

（上海交通大学 生物医学工程学院，上海 200030）

近一个世纪以来，光在生物组织中的传播与分布，以及光与生物组织的相互作用引起了科学家们的广泛关注，引发了光学方法在生物医学检测与成像领域的研究热潮。生物光学是利用光学探测手段对内源性分子或外源性标记物（如造影剂）、细胞或者组织甚至整个生物体进行检测与成像，以获得其中生物学信息的方法。光学技术的发展几乎贯穿整个人类的科学技术发展史，而光学技术与生命科学和医学等各个领域的交叉融合则可追溯至17 世纪：Robert Hooke 利用多片透镜组合制作了复合式显微镜并首次观察到了植物的细胞结构，Antoni van Leeuwenhoek 也通过类似于显微镜结构的自制放大镜首次观察到了微生物。与此同时，光波动说的兴起，推动了基于衍射成像理论的显微镜的诞生。19 世纪，Carl Zeiss联合Ernst Abbe和Otto Schott发明了首台可达光学衍射极限的显微镜，大大地推动了光学成像的发展。20 世纪，光电探测器的发展，世界上第一台激光器的诞生，以及激光扫描共聚焦显微镜、双光子显微镜等相继出现，都为光学成像在生物医学领域的应用带来了无限的可能性。

与传统医学成像方法相比，光学成像的优势主要体现在以下几个方面［1］：（1）具有特异性，且在分子水平上具有很高的灵敏度和选择性，能够表征生物体的结构或功能信息；（2）光学成像的对比度多样，利用透射、反射、散射、吸收、荧光和光谱信息中的一种或几种，可进行多维/多模态成像；（3）具有较好的生物安全性，光学成像采用电磁波作为激发源，避免了电离辐射对人体的危害；（4）时空分辨率高，成像尺寸范围从几十纳米到宏观物体，成像速度快、可调；（5）成像范围广，体内外的成像均可实现；（6）设备简单，操作简便，成像成本低。迄今为止，光学成像已被广泛用于临床前和临床诊疗的各个领域。例如在基础科学领域，荧光、生物/化学发光、拉曼等标记技术配合各种成像技术能够在细胞、组织以及器官甚至整个人体水平进行肿瘤学和药学等多方面的研究。临床诊疗方面，基于外源性成像造影剂吲哚菁绿的荧光成像是淋巴结示踪的绝佳工具［2］，内窥镜技术可以对人体的呼吸道、肠胃道、泌尿道和肝胆胰等进行无创或微创的检查与治疗［3］。牙科中用来检测牙结石的紫外照明荧光成像，眼科常用的光学相干断层成像和宽场眼底相机等都应用了光学成像的原理。此外，光学方法在体外诊断方面的研究也已有报道，例如，利用荧光成像或拉曼成像进行的试纸条侧流免疫层析分析等［4］。

如上所述，光学成像独特的优势使其在生物医学领域具有十分重要的意义和广阔的应用前景［5-6］。然而，由于生物组织对光子存在高散射与高吸收等特性（图1）［7］，光的组织穿透性通常非常有限，研究者们对此做了大量的努力。常见的光学成像方法包括激光散斑成像、光学相干断层扫描、荧光成像、生物/化学发光成像、光声成像以及拉曼成像等。本文将对上述常见的光学成像技术在组织穿透性方面的研究进展进行总结与讨论，并展望它们在组织穿透性方面未来研究的主要方向。激光散斑成像和光学相干断层扫描等成像技术空间分辨率高（如微米级），通常用于数百微米到毫米深度水平的研究［8-9］，这里不再做详细展开，下文主要对荧光成像、生物/化学发光成像、光声成像以及拉曼成像几种常见的光学探测技术进行详细介绍。

图1 激发光引起的光-组织相互作用［1］（A），不同生物组织和脂肪乳组织仿体的约化散射系数在400~1 700 nm区域随波长的变化［7］（B），人体血液中脱氧血红蛋白（蓝色）和氧合血红蛋白（红色）在1 mm长路径上的吸收光谱［7］（C），水通过1 mm长路径的吸收光谱［7］（D）Fig.1 Light-tissue interactions resulting from impinging excitation light［1］（A），reduced scattering coefficients of different biotissues and of intralipid tissue phantom as a function of wavelength in the 400-1 700 nm region［7］（B），absorption spectra of deoxyhaemoglobin（blue） and oxyhaemoglobin（red） through a 1-mm-long path in human blood［7］（C），absorption spectrum of water through a 1-mm-long path［7］（D）

1 荧光成像

荧光现象在19 世纪中期被发现，并在20 世纪初第一台荧光显微镜问世后在生命科学领域崭露头角［10］。荧光成像的医学应用可以追溯到1924年，当时在紫外线照射下观察到了肿瘤中内源性分子卟啉的荧光信号［8，11］。荧光成像以荧光报告分子为标志，所用到的荧光材料包括无机材料，如上转换材料、量子点，荧光蛋白以及其他有机材料等［12-14］。荧光成像技术的出现极大推动了微观、介观和宏观成像系统，以及成像探针、微型化光纤方法等的发展，现已成为生命科学和医学领域发展最快以及适应能力最强的成像技术之一。

1.1 荧光显微技术

荧光显微技术是较早发展起来的荧光成像技术。激光经过物镜照射在样品上并激发出荧光，被激发出的荧光经过同一物镜后被检测器收集（图2A）。常见的荧光显微成像技术有激光扫描共聚焦显微成像、多光子（包括双光子和三光子）显微成像等。激光扫描共聚焦显微成像成本低、应用广泛，可以实现样品断层扫描成像与无损观察，并可对细胞进行三维空间结构分析等。但可见光的组织穿透深度有限，且如果长时间观察，光毒性易导致细胞死亡。近年来，基于近红外光的双光子显微技术引起了学术与工业界的广泛关注。双光子吸收是指同时吸收两个光子，是一种典型的非线性吸收过程［1］。双光子吸收的光学跃迁与吸收光强的平方有关。双光子显微技术常用飞秒激光作为激励。飞秒激光脉冲超短，可以提供较高的峰值功率和较低的平均功率。三光子吸收则是指同时吸收三个光子。与双光子显微镜相比，三光子显微镜可以获得更大的成像深度，但其对激光源和探测器的要求远高于双光子显微镜。目前多光子显微成像已可获得2 100 µm 以上深度的清晰血管二维图像（图2B），且其失焦光漂白小，从标记荧光物体（通过多个通道检测）和二次谐波信号发出的光产生三维信息，可以在高空间分辨率下提供数小时的成像时长［15］。多光子显微镜有许多固有优点，包括提高穿透深度（近红外光激发减少了生物组织中的散射和吸收）和减少光损伤。然而，受超快和高功率的激光器限制，多光子显微镜的成本较高，此外因为使用了更长波长，其分辨率理论上会下降。基于光纤的成像技术已被应用于活体显微镜，可实现原位成像，而小型化系统则使其在基于内窥镜的临床成像中具有重大优势［16］。荧光显微成像技术与激光散斑成像和光学相干断层扫描等成像技术类似，具有较高的空间分辨率（例如微米级），它们在数百微米到毫米水平的深度领域具有广阔的应用前景，例如可对细胞、组织切片和表层皮肤组织等进行超高分辨率的分析，但不适用于表面肿瘤（如异种移植）、手术暴露器官以及整个人体等的检测。

图2 荧光显微技术示意图［1］（A），成年小鼠体内血管的深部脑结构多光子显微镜成像［15］（B），在体宽场荧光成像示意图（i）和吲哚菁绿（ICG）的光致发光光谱及静脉注射ICG后的裸鼠荧光图像（ii）［1，17］（C），FMT几何结构示意图（左），FMT成像系统（中）和在不同组织外围获得的理论平均荧光光子数与组织直径的关系曲线（右）［18-19］（D）Fig.2 Schematic diagram of fluorescence microscopy［1］（A），in vivo deep-brain structural multiphoton microscopy images of blood vessels in adult mouse［15］（B），schematic illustration of the in vivo wide-field fluorescence imaging（i） and the photoluminescence spectra of ICG and fluorescence image of nude mice after intravenous injection of ICG（ii） ［1，17］（C），schematic diagram of FMT geometry（left），FMT imaging system（middle） and theoretical average fluorescent photon counts expected at the peripheries of different organs as a function of diameter（right）［31-32］（D）inset B：left：3D reconstruction of multiphoton microscope images of a mouse brain in vivo；right：2D image showing a blood vessel at depth of 2 100 µm（左侧：在体小鼠大脑多光子显微镜图像的3D重建，右侧：2D图像显示深度为2 100 µm的血管）

1.2 在体宽场荧光成像技术

为获得更高深度的检测与成像能力，研究者们以牺牲部分横向分辨率为前提发展成像技术，并配合使用高灵敏度的外源性造影剂，将荧光成像技术的深层检测能力提高至数毫米及以上水平。例如在面向在体的宽场荧光成像技术（图2C）中，组织样本（如动物或人体）通常是被宽入射光束照射（该入射光束被调至感兴趣的波段），同时利用低噪声电荷耦合装置在发射波长处拍摄高灵敏度图像，搭配合适的滤光片和大孔径透镜，可提高光子收集效率［1，17］。这是目前最常见的大范围荧光成像方法，当在同一侧激发并收集荧光信号时称为荧光反射成像（FRI），而透射式的荧光成像技术则从照明源的对侧收集图像。荧光成像使用光谱信息来区分不同的荧光颜料。例如，Yang等［18］证明，通过监测绿色荧光蛋白的荧光信号，可以对生长中的肿瘤进行简单和无创的成像，进而实现肿瘤在活鼠体内生长和转移的实时监测。荧光成像的对比度常受生物组织自体荧光的影响，Xu等［19］使用光谱解混技术提高检测对比度，该技术是一种可以根据光谱特征将多种荧光染料与非特异性背景荧光区分开的技术。宽场荧光成像尤其是荧光反射成像在技术上易于实现，操作简单，为进行高通量与快速的生物成像提供了强有力的工具。目前，这项技术已经可以用于手术治疗卵巢癌［20］、前列腺癌［21］、乳腺癌［22］、黑色素瘤［23-24］、外阴癌［25-26］和宫颈癌［27］等疾病。宽场成像扩大了入射光斑尺寸，降低了入射激光功率密度（远低于美国国家标准协会规定的最大激光照射量（MPE）阈值，低于该阈值的辐射量对被照射的表面组织产生的损伤可忽略不计），并可得到清晰与高对比度图像，是在体检测荧光报告分子最简单的成像技术，广泛地影响了生物医学研究［28］。由于主要集中于对浅层结构进行观察，目前基于单角度投影的宽场荧光成像所能获取的深度信息通常在毫米到厘米范围［29］。

1.3 荧光断层扫描技术

荧光断层扫描（FMT）基于多个光源-探测器对或多角度投影的方式进行检测（图2D），这种方式大大提升了荧光探测技术的探测深度。研究者们根据理论模拟的数据，认为FMT 可以将荧光源的信号检测深度提升至数个厘米水平，例如在纯肌肉组织中可提高至7 cm，半透明的乳房组织中则可提高至将近14 cm［30-31］。此外，FMT还可提供定量信息，通过对收集的数据进行重建，获得荧光信号源的三维空间分布信息［30，32］。FMT 由扩散光学层析成像（DOT）发展而来，两者均以光子在介质中的扩散原理为基础［33］。不同的是，DOT是利用吸收效应来对组织固有的吸收物质（通常为血红蛋白和脱氧血红蛋白有关的内在结构）进行重建，而FMT 则是利用吸收和荧光测量对荧光染料进行重建。FMT 通过采用光纤光源或顺序扫描点光源代替宽场成像模式下的广域照明，以延长测量时间为代价来对每一个单独的光源探测器进行测量［34］。2001年，Ntziachristos等首次开发了用于科研实验的FMT系统，在浑浊介质中重建了荧光团的空间分布，整个过程可控制在10 min 左右，并将其用于小鼠脑瘤、纤维肉瘤等的检测研究［33，35］。早期的FMT 系统采用将小鼠浸泡在指数匹配的液体中的方式，以简化与边界建模相关的理论约束来计算光传播。通过不断改进，在非接触情况下，FMT 系统已经可以实现多种形状物体的重建，并可进行360°旋转检测，提高了重建分辨率［36-37］。FMT 的灵敏度高，适用范围广，但空间分辨率相对较低（~1 mm）［8］。分辨率受限于光在组织中传播的物理性质、样品的解剖特征和组织光学参数的不确定性等。因此，FMT多与计算机断层扫描（CT）/磁共振成像（MRI）等结合，利用后者提供结构先验信息构建正演模型，以此改进光子的重建和视图的可视化［34，38］。此外，由于近红外二区窗口的低散射特性，也有研究者将FMT的探测窗口从近红外一区拓展到近红外二区，以此来降低散射效应对FMT信息获取的影响［39］。FMT 高的组织检测能力与优异的信息获取能力使其在使用人类疾病动物模型研究新的诊疗方法中展现出强大的生命力。

2 生物/化学发光成像

生物/化学发光成像无需外部光源照明即可直接收集物体内部产生的光信号，避免了组织中固有荧光背景的影响，成像对比度高，同时具有更大的组织穿透潜力（相对于荧光成像而言）。

2.1 化学发光

化学发光是指某些物质在参加化学反应的过程中由于吸收了反应产生的化学能而被激发，并向外辐射光能量的过程。化学发光的灵敏度高，据报道，化学能转化为光能的效率几乎可达100%。目前化学发光成像的探测深度通常可达厘米水平。2020年，唐本忠团队与罗亮团队合作开发了一种化学共轭的近红外化学发光材料［40］。他们通过将鲁米诺（Luminol）与三苯胺-苯并噻二唑结合物（Triphenylaminecombined benzothiadiazole，TB）偶联，合成了具有聚集诱导发光活性的近红外化学发光发射体TBL（Triphenylamine-combined benzothiadiazole conjugates with luminol，TBL）分子，并利用表面活性剂制备了直径约为20 nm 的TBL 纳米颗粒。该TBL 纳米颗粒的近红外化学发光可以最高穿透3 cm 厚的火腿组织并被检测器检测到（图3），并且能够区分肿瘤组织和正常组织，在深部生物组织成像、原位癌症诊断和手术治疗领域都表现出良好的潜在应用前景。

图3 不同猪火腿肉片覆盖下的TBL（三苯胺和苯并噻二唑的结合物偶联鲁米诺）颗粒近红外化学发光图像（序号代表覆盖的肉片数量）（A），猪火腿肉片的照片（10片肉片的总厚度为3 cm，每片肉片的厚度~3 mm）［40］（B）Fig.3 Near-infrared chemiluminescence images of TBL（triphenylamine-combined benzothiadiazole conjugates with luminol）dots covered by different slices of pork ham（the serial number represents the number of slices of pork ham covered）（A），photograph of pork ham（the total thickness of 10 slices is 3 cm and the thickness of each slice is ~3 mm）［40］（B）

2.2 生物发光

生物发光是一种特殊类型的化学发光，是指生物体发出的光辐射，其发光强度与标记细胞的数量呈线性相关性。生物发光成像是利用荧光素酶基因标记细胞或DNA，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，然后将标记好的细胞接种到动物体内，再外源性给予荧光素，在三磷酸腺苷、氧气存在的条件下，荧光素酶和荧光素反应，生成氧化荧光素并发光，最后利用光学检测器直接监测活体中细胞活动和基因行为的成像技术。通过该技术，可以观测活体内肿瘤的生长与转移、疾病的发展以及特定基因表达等生物学过程。生物发光成像的探测深度通常也可达厘米水平，例如将生物发光染料的发射波长扩展至近红外区域可以对活体小鼠的整个身体（>1 cm）进行探测［8，41］。生物发光成像目前已被用于蛋白质-蛋白质相互作用、基因表达模式和基因功能、传染病与干细胞免疫学以及细胞凋亡等研究［42-45］。与荧光断层扫描类似，生物发光也可以实现断层扫描获得三维信号源分布信息，并得到量化信息［46-47］。然而，外部光源的缺乏使生物发光层析成像（BLT）复杂化，导致其数学上的建模和解析更加困难，而且准确性可能降低。结合多视角成像和组织异质性的先验信息可以提高生物发光逆问题求解的能力。2006年，有研究建立了一个独立的BLT/CT双模式成像系统，先对小鼠进行BLT数据采集，然后确保小鼠不动再采集CT 数据，最后利用从CT 中获取的解剖信息对小鼠进行BLT 重建，提高了BLT 成像的准确性［48］。生物发光层析成像在体内的应用正在研究阶段，未来有望得到应用。

化学/生物发光成像无需外部光源照明，避免了背景组织信号对检测信号的影响，在深层成像领域中具有良好的应用前景。然而其适用范围受到一些限制，例如有些物质无法进行生物发光标记，如抗体、多肽等。

3 光声成像

光声成像（PAI）是一种融合了光学照明和超声检测的成像模式，同时具备光学与超声检测的优势，近几十年在生物医学成像领域获得了飞速发展［49］。如图4A所示，光声成像技术通常使用短脉冲光源作为入射能量，内源性色素团（如氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白）或外源性造影剂（如有机染料和纳米颗粒）吸收入射光源并将光能转化为热能使温度上升，发生热弹性膨胀及发射出超声波并被超声检测器收集。由于声信号在组织中的散射和衰减通常比光信号少得多，因此基于光声的成像模式具有以更大的组织穿透性确定组织中光学吸收物质信息的潜力［50］。光声成像可以在光学和声学两个维度上缩放其空间分辨率和成像深度，基于光学分辨的光声显微镜（OR-PAM）具有较高的侧向分辨率，但其成像深度通常限制在1 mm左右［51］。而当空间分辨率由声学定义时，虽然高的中心频率换能器可以提供高的空间分辨率，但频率相关的声学衰减也会限制成像深度。因此，基于声学分辨的光声显微镜（AR-PAM）系统的成像深度通常为几毫米［52］。低频的传感器通常用于光声断层扫描（PAT），并已被证明可深入5.2 cm的离体鸡肉组织检测目标物的光声信号（图4B），而对应的入射激光辐射量仅为美国国家标准协会规定的皮肤最高激光照射阈值的七分之一，远低于FMT 所需的辐射剂量［28，53-54］。且如果采用新的照明方案，例如通过从两侧照亮物体，可使成像区域翻倍，实现更高的成像深度［55］。将激发波长拓展到近红外二区也可以提高成像深度，例如有报道利用基于磷酞菁的有机探针在1 064 nm 下进行光声断层扫描成像，在鸡胸组织中达到了11.6 cm 的成像深度［56］。随着光声断层扫描技术的发展，光声成像在基础科学、临床前研究和临床转换等领域具有广阔的应用前景。然而，声学带来高穿透性的同时，也带来了其固有的局限，例如骨头和气腔会阻碍超声传播，对肿瘤的探测灵敏度低等，限制了其在相关疾病诊断中的适用性。

图4 光声成像（PAI）的原理图［50］（A），深入穿透生物组织的PAI［54］（B）Fig.4 Principle of photoacoustic imaging（PAI） ［50］（A），deeply penetrating PAI in biological tissues［54］（B）photographs of the cross-section of chicken breast tissue in which a transparent tube containing methylene blue is embedded（i） and the entire sample（ii），PAI of the tube containing methylene blue（iii），overlaid PAI（pseudo color） and US（gray） image（iv）；the thresholded photoacoustic signals in the yellow dotted box in（iii） were overlaid with the US image in（iv）（嵌入含有亚甲基蓝的透明管的鸡胸组织横截面（i）和整个样品的照片（ii），含有亚甲基蓝管的PAI（iii），PAI（伪彩色）和US（灰色）重叠图像（iv）；（iii）中黄色虚线框内的阈值光声信号与（iv）中的超声图像叠加）

4 拉曼成像

拉曼散射（Raman scattering），又称拉曼效应，是指入射光波被物质散射后频率发生改变的现象，可以用分子的振动能级进行解释。若出射光与入射光频率一致，则称为瑞利散射，两种散射的分子振动能级图如图5A所示［57］。当有入射光照射到样品时，该样品的分子产生的振荡极化导致电子跃迁到受激虚态，处在虚拟能级上的电子会向低能级跃迁并向外辐射光子即散射光。当入射光能大于散射光能时，称为斯托克斯（Stokes）散射；入射光能小于散射光能时，则称为反斯托克斯（anti-Stokes）散射，Stokes和anti-Stokes散射统称为拉曼散射［58-62］。Stokes散射通常比anti-Stokes散射强很多，因此，拉曼光谱仪检测的通常为Stokes 线。入射和散射光子的能量差与入射光波长无关，只与材料不同振动能级的能级差有关。

图5 拉曼散射与瑞利散射分子振动能级图［57］（A），表面增强拉曼散射现象［65］（B），局域表面等离激元共振效应示意图［67］（C），传统的背散射拉曼检测示意图：激光激发和拉曼光子收集发生在同一点［74］（D）Fig.5 Diagram of Raman scattering and Rayleigh scattering molecular vibrational energy levels［57］（A），surface-enhanced Raman scattering phenomenon［65］（B），schematic diagram of localized surface plasmon resonance effect［67］（C），schematic of conventional backscattering Raman geometry：laser excitation and Raman photon collection take place at the same point［74］（D）

拉曼成像是指利用拉曼散射现象进行成像的手段，一般包括逐点扫描拉曼成像和宽场拉曼成像［63］。逐点扫描拉曼成像是最常见的一种拉曼成像方式，指在样品的感兴趣区域逐点激发并采集拉曼信号生成的图像［64］。宽场拉曼成像则是将宽光束激光照射到样品上感兴趣的区域，散射光从整个区域被同时采集并被过滤，只有选定的较窄波段范围内的拉曼散射光子被收集［63］。

4.1 表面增强拉曼光谱技术

拉曼光谱具有分子指纹特征，可以与背景很好地区分开；拉曼峰宽极窄，非常适合进行多重检测或成像；且拉曼信号稳定性较高，不易发生猝灭或漂白。特别地，当分子靠近或吸附在金属纳米结构表面时，在入射光的激发下，分子的拉曼信号可被极大地增强，增强因子高达1014~1015，该现象称为表面增强拉曼散射（SERS）效应（图5B）［65-66］。SERS 效应自1974 年被首次发现以来，已被广泛研究，其增强机制主要有两种：电磁场（EM）增强和化学增强效应。EM 增强由金属纳米结构的局域表面等离激元共振（LSPR）效应引起，占主导地位。当照射到纳米金属结构与介质界面的入射光频率与金属中的自由电子振荡频率一致时，金属表面的自由电子会产生集体振荡，这一现象被称为LSPR 效应（图5C）［67］。LSPR 会导致金属纳米结构上局域电场的再分配，使在金属纳米结构表面附近形成一个电磁场增强区域，该区域通常被称为“热点”。吸附在“热点”附近的分子除可以获得极强的入射激光激发外，其拉曼散射过程也可以以同样的方式被增强。

基于SERS 效应制备的纳米探针称为SERS 探针，主要由金属纳米基底和拉曼报告分子两部分组成，有些SERS 探针还包括保护层和靶向分子［68］。与荧光染料和量子点等类似，SERS 探针也具有光学标记功能，是一种新型的成像造影剂［69-70］。近年来，SERS探针由于特异性强、灵敏度高、不易受光漂白、不受组织背景荧光干扰等优点，被广泛应用于多重检测或成像，已成为最具发展前景的光学探针之一。目前SERS探针在小鼠脑胶质瘤、前哨淋巴结和前列腺癌等模型中均成功实现了肿瘤边缘浸润和多灶性局部肿瘤扩散的精确成像［71-73］。常规的拉曼检测方式是背散射式检测（图5D）［74］，然而由于生物组织对光子的散射和吸收较强，背散射拉曼检测受到组织穿透深度的限制，一般约为几个毫米［75］。

4.2 深穿透拉曼光谱技术

深穿透拉曼光谱（DRS）技术的出现极大地提高了拉曼光谱的深层检测与成像能力［74，76-77］。DRS 检测基于生物组织的高散射特性，即来自深层的光子到达组织表面时会产生较大的空间偏移。因此DRS技术在空间上对激光入射区域与信号收集区域进行分离，有效抑制了浅层的背景信号，并可获取更多来自深层的拉曼光子，从而提高来自深层目标物（即信号源）的信背比，实现更大的检测深度。深穿透拉曼光谱技术通常包括两种形式：空间偏移拉曼光谱（SORS）和透射拉曼光谱（TRS）。

SORS 由Matousek 等在2005 年提出［78］，他们通过在激发区域和收集区域之间实现一定的背向散射物理偏移，获取了更高信背比的深层信号源的信号，并将利用该检测方式获得的光谱称为空间偏移拉曼光谱（图6A）［78-79］。SORS与SERS的结合，称为表面增强空间偏移拉曼光谱（SESORS），该技术兼具了SERS 的信号增强能力与SORS 的深穿透优势，可以实现更深层的样品检测。空间偏移量仅为微米到毫米水平时，即可在深达0.5~0.675 cm 的离体猪肌肉组织和0.8 cm 的骨中检测到SERS探针的信号［80-82］。此外，Nicolson 等［83］将灵敏度更高的表面增强共振拉曼散射（SERRS）探针与空间偏移拉曼光谱相结合，成功通过2.5 cm 厚的离体猪肌肉组织检测到该纳米探针的信号，并实现了离体猪肌肉组织1.5 cm深处三维乳腺癌肿瘤模型的检测。Berry 等［84］则利用SORS 技术成功检测到埋在4.8 cm 猪肌肉深处的SERS探针的信号，是目前报道的利用SORS技术实现的最大离体组织检测深度（图6B）。最近，Nicolson等［85］继续成功在活体小鼠中通过颅骨检测出胶质母细胞瘤多形性肿瘤（图6C）。虽然此项研究已经证实了在体小鼠肿瘤的共振SESORS成像，但探测深度仅限于穿过小鼠颅骨的厚度（~0.2 cm）。

图6 SORS原理图和利用514 nm波长测量由1 mm 聚甲基丙烯酸甲酯球层和2 mm反式二苯乙烯粉末层组成的双层系统收集的拉曼光谱［78-79］（A），使用手持式SORS光谱仪通过60 mm猪组织追踪1，2-二（4-吡啶基）乙烯（BPE）纳米探针［84］（B），整合素靶向SERRS纳米探针的示意图、用于多形性成胶质细胞瘤的体内成像以及使用SORS成像方法通过颅骨检测到的SERRS探针/骨的约束最小二乘贡献结果［85］（C）Fig.6 Principle of SORS and Raman spectra collected from a two-layer system consisting of a 1 mm layer of poly（methyl methacrylate）（PMMA）spheres followed by a 2 mm layer of trans-stilbene powder measured using the 514 nm probe wavelength［78-79］（A）（ΔS：spatial offset），the tracking of BPE nanotags through porcine tissue up to 60 mm using a handheld SORS spectrometer［84］（B），concept of integrin-targeted SERRS-nanotags for in vivo imaging of glioblastoma multiforme using SORS and the detection and constraint least squares contribution of SERRS NPs/bone through the skull using a SORS imaging approach［85］（C）

TRS 是DRS 的另一种形式［86］。TRS 通过将激光入射区域和拉曼探测区域分离在样品的对侧实现检测（图7A）［87］，可被认为是SORS 的一种特殊形式，即其激光照明区域和信号收集区域的空间偏移量达到了无限大，因此TRS 与SORS 一样，均具有深层检测能力［88-89］。但与SORS 不同的是，TRS 模型反映的是检测体积内整体信息的组成，因此不受检测系统的影响或不同空间偏移量采样问题的限制，这使其在非侵入性检测样品内部信息领域（如药物样品的主成分含量等）具有广阔的应用前景。例如Aina等［90］使用TRS 对待测药物模型配方中的多晶成分含量进行定量研究，结果表明，使用TRS 对多晶型进行量化的准确性远远超过基于SORS 的准确性。此外，该技术还有效抑制了从涂层或胶囊层发出的荧光和拉曼信号。

图7 透射拉曼光谱示意图［87］（A），透射拉曼测量示意图（左）及不同厚度猪肉组织覆盖下测得的透射拉曼光谱（右）［93］（B），将SERS管（填充有SERS纳米探针）埋在猪肉组织中的TRS装置照片和将SERS管放置在信号收集面（d=0）时透过不同厚度的猪组织收集到的拉曼光谱［94］（C），对深部肿瘤进行无创体内成像的示意图和SERS凝胶（含有SERS纳米探针的琼脂糖凝胶充当肿瘤类似物）的植入过程照片（左）以及透射成像结果（右）［94］（D）Fig.7 Schematic diagram of TRS ［87］（A），schematic diagram of transmission Raman measurement（left），transmission Raman spectra measured with different thicknesses of pork tissue covering（right）［93］（B），the photograph of TRS setup with a SERS tube（filled with SERS nanoparticles） buried in pork tissue and the collected Raman spectra through pork tissue with different thicknesses when the SERS tube was placed on the collection surface（d=0）［94］（C），schematic of noninvasive in vivo imaging of deepseated tumor and photographs of the implantation process of SERS gel（agarose gel containing SERS nanoparticles that act as tumor analogues）（left），and the transmission imaging results（right）［94］（D）the inset in D shows the photograph of the two SERS gel cubes and the green box indicate the plane positions of the two SERS gels（D图插图展示了两个SERS凝胶立方体的照片，绿色框表示两个SERS凝胶的平面位置）

除上述优势外，基于检测形式的差异，TRS的可穿透组织厚度理论上可达SORS可检测深度的两倍或以上，这是因为SORS 收集的是背向散射拉曼光子，入射光进入到组织并激发拉曼光子后，该拉曼光子必须再按原方向返回到组织表面才能被检测到。近年来，将TRS与SERS相结合的表面增强透射拉曼光谱（SETRS）技术为医疗应用开辟了新的途径，如进行骨成分分析和癌组织分析等［86，91］。Xie等［91］将纳米探针放置在2 cm 厚的猪肌肉组织样本中，通过SETRS从骨骼表面的纳米探针精细分布中获得可识别的纳米探针信号，证明了SETRS 具有非侵入性跟踪体内双膦酸盐的潜力。Stone 等［92］将4 种独特的SERS纳米颗粒注射到一个厚2 cm 的猪组织块中，首次从2 cm 厚的组织中检测到多重SERS信号，并重建出伪彩色图像证明了SETRS进行多重成像的能力。而通过增加纳米颗粒的数量/浓度，他们还成功透过5 cm 厚的猪肌肉组织检测到了埋在其中的SERS纳米探针信号。此外，2022年Stone等通过进一步研究并使用更大的颗粒注射剂量，利用SETRS 成功通过厚度约7.1 cm 的生物组织检测到了小鼠肿瘤（图7B）［93］。

为了进一步提高可探测的组织厚度，最近本研究小组从光子在透射拉曼检测中的传播过程以及测量因素入手，系统研究了实验参数（组织厚度、SERS 探针的深度位置、探针亮度、激光功率和光斑尺寸）对SETRS 探测厚度的影响［94］，发现：（1）透射拉曼信号与信号源的深度位置之间呈不对称的U 型关系，说明病变位于组织中部时信号最弱，对SETRS 的检测最具挑战性；（2）提高SERS 探针的亮度是增加检测深度/透射组织厚度最直接有效的途径；（3）激光光斑尺寸的增大对深部病灶的透射拉曼信号强度几乎没有影响。因此，可以采用较大的激光束尺寸来降低功率密度，这对SETRS 的临床转化至关重要，因为过高的激光辐射量会对被照射的组织表面造成潜在的光辐射危害。基于上述发现，笔者团队设计制备了超亮的近红外SERS 探针，开发了一个具有深层检测能力和光安全性（即入射激光剂量低于MPE阈值）的拉曼检测/成像系统。基于该系统，首次利用符合MPE标准的入射实现了包埋在体外14 cm厚的猪组织中SERS探针的检测（图7C），比目前已报道的TRS最高检测厚度提高了约1倍。该数值接近成人身体的厚度（腹部-背部距离15~30 cm），揭示了将TRS技术推向人体无创全身检查的可能性。此外，还在MPE标准内实现了未剃毛小鼠（1.5 cm厚）体内深层SERS探针的活体无创成像（图7D）。相比之下，传统的背散射检测方式无法实现拉曼成像。该工作为透射拉曼光谱技术在体内非侵入性生物医学检查方面的发展提供了新的思路，证明透射拉曼光谱有望成为未来临床癌症诊断的可行工具。

5 总结与展望

综上所述，随着光学探测技术的不断发展，已产生出了针对不同检测深度进行研究的成像技术，组织深度覆盖微米到数厘米甚至10 cm以上的范围（表1），并且所使用的入射激光剂量能够在临床安全范围内，极大地提升了光学检测与成像技术的临床转化能力。例如基于深穿透拉曼光谱的拉曼检测与成像技术特异性强，目前已能透过14 cm 的生物组织探测信号，在生物检测、成像、诊断、术中导航等领域具有广阔的应用前景。深度限制的进一步改进将极大地促进治疗策略设计、手术规划和手术导航技术的完善以及临床应用的发展。预计未来可从以下几个方面继续深入研究，进一步提高光学检测与成像技术的深层探测能力：

表1 各个成像模态的组织检测深度与特点Table 1 Tissue detection depths and characteristics of each imaging modality

（1）将光学窗口拓展至更长的波长，如近红外二区（NIR-Ⅱ），以降低生物组织对光子的散射及吸收作用，包括NIR-Ⅱ成像探针的设计与合成以及具有高灵敏度的NIR-Ⅱ检测装置的设计与搭建［7，75，95］；

（2）结合组织光学透明化技术，降低生物组织对光的散射与吸收，提高光子在组织中的穿透能力［96］；

（3）对于需要激发光源的荧光、光声和拉曼成像技术，可以结合波前整形技术，实现散射介质深处的光学聚焦，提高病变处产生的信号强度，进而提高生物组织的检测深度/厚度极限［97］；

（4）利用多角度投影和检测的方式提高穿透性能。目前部分光学探测技术例如荧光成像（荧光分子断层扫描）和光声成像（光声断层扫描）已利用多角度投影与检测的方式实现了更高的探测深度，未来深穿透拉曼光谱技术可从该方向入手，进一步提高检测深度至超过成人躯干厚度水平（腹部-背部距离15~30 cm）［30-31，53］。

此外，纳米探针在体内的生物相容性和靶向肿瘤的效果也值得关注，可以通过选择合适的表面修饰或配体来改善颗粒的体内适用性。开发局部注射和使用纳米探针的体内应用场景（如前哨淋巴结成像）也是非常有前景的研究方向。在这些场景下，需要在前哨淋巴结/病灶周围注射纳米探针，探针在前哨淋巴结/病灶中富集，而去除前哨淋巴结/病灶以及包含在其中的纳米探针将会显著降低生物安全的风险。另外，随着生物光学成像技术深层检测能力的不断提高，一些病灶定位方法的发展，包括病灶深度快速预测原理、深度预测算法、光学重建算法以及多个探测角度等软件和硬件的配合，将使光学检测与成像技术的应用更加广泛［84，98-100］。