纳米抗体在自身免疫性疾病中的应用

敖正宏 王玥 梅雅贤 罗文新

（厦门大学公共卫生学院，国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，厦门 361102）

自身免疫性疾病是由于机体免疫功能障碍，免疫耐受丧失，导致机体免疫系统识别自身抗原而产生的炎症性疾病［1-3］。近年来，自身免疫性疾病的发病率逐渐上升，流行病学研究表明该类疾病已经影响了全球5%～8%的人口［4-6］。自身免疫性疾病可以发生在任何年龄，女性发病率高于男性，且受到环境、遗传等因素的影响［7-10］。目前，这一异质性疾病已成为仅次于癌症和心血管疾病的公共卫生负担［11］。已知的自身免疫性疾病约有80种，包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化等［5-6，11］。

自身免疫性疾病的发病机制目前仍不十分清楚。通常认为其发病受到遗传和环境因素的影响，还与自身抗原的出现、免疫调节紊乱和基因表达异常相关［5］。目前，自身免疫性疾病的治疗药物主要有非甾体类抗炎药、肿瘤坏死因子（TNF-α）抑制剂等，然而这些药物会带来严重的副作用，高达40%的患者对抗肿瘤坏死因子治疗无反应［12-13］。研究发现，自身免疫性疾病的发病还与细胞因子有关，在自身免疫性疾病中，多种细胞因子及其在免疫细胞上的受体组成了高度复杂的网络，从而驱动炎症反应，靶向这些疾病相关分子的许多治疗性抗体已被开发用于治疗自身免疫性疾病［14］。常见的细胞因子靶点有IL-17、IL-23、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、TNF-α、、IL-6等。

1 纳米抗体

1980～1995年，研究人员发现骆驼科动物和部分软骨鱼类体内存在天然缺失轻链的重链抗体，分别命名为重链抗体（heavy chain of antibodies，HCAbs）和Ig新抗原受体（immunoglobulin new antigen receptors，IgNARs），其抗原结合部位分别为HCAb的重链可变区（variable domain of heavy chain anytibodies，VHHs）和Ig-NARs的重链可变区（Ig-NARs heavy new antigen receptors，V-NARs），它们可以在体外单独而稳定地存在，VHHs也被称为纳米抗体［15-17］。然而，由于骆驼类物种通常更容易获取和处理，免疫后产生HCAb反应更强，并产生与人类具有较高同源性的免疫球蛋白，VHHs作为生物药物比VNARs更有吸引力［18］。

纳米抗体结合了单克隆抗体与小分子药物的优势，使其成为开发新治疗药物十分有潜力的方向［19］。纳米抗体相比于传统单克隆抗体，在治疗自身免疫性疾病中具备许多优势：第一，纳米抗体的相对分子质量非常小，为12～15 kD，约为传统单克隆抗体的1/10［19-20］。这有利于其穿透实体组织，透过血脑屏障，治疗发病于中枢神经系统的自身免疫性疾病［21］。第二，纳米抗体易于改造和连接。一种自身免疫性疾病的发病通常与多种细胞因子有关，纳米抗体可以用甘氨酸-丝氨酸连接物连接，以获得具有多种特异性的分子，同时靶向多种细胞因子及其受体［22-23］。纳米抗体的组合具有协同阻滞作用，并不影响其阻断功能，还可以增强亲和力和特异性［24-25］。第三，避免毒性作用。纳米抗体的半衰期通常较短，需要高剂量和频繁给药，但是目前已经找出了几种解决方法，包括添加聚乙二醇、与人血清白蛋白结合或与传统抗体的Fc段融合［25-26］。与人血清白蛋白结合产生了一个额外的优势，即复合物将针对白蛋白积累的区域，主要是炎症区域［27］。然而，对于某些特定应用而言，纳米抗体快速肾脏清除和缺少Fc的效应功能可以避免毒性作用［25-26］。第四，易于开发和稳定生产。由于治疗自身免疫性疾病的生物制剂通常靶向正常人体免疫细胞、生长因子、趋化因子等，最直接的药物开发途径为筛选全人源抗体。相比于传统抗体，纳米抗体没有轻链，其制备适用噬菌体展示技术，避免了轻重链错配的问题，降低了生产的难度与成本［20，28］。源于驼类动物的纳米抗体与人同源性高达80%，使其在人体内表现低的免疫原性，且更易于人源化［21，29］。与传统抗体相比，由于缺乏n-链寡糖的Fc段，纳米抗体可以在微生物中表达，显著节省了成本、人工和时间［30］。此外，纳米抗体还具备溶解性好、亲和力高、稳定性好、可以结合传统抗体不易到达表位等优点［16，26，30-34］。

从骆驼科动物的外周血细胞中分离序列并将纳米抗体克隆到噬菌体载体上，建立噬菌体文库，并借助噬菌体展示技术可筛选出亲和力高、特异性强的纳米抗体［35］。天然库、合成库、免疫库都可以用来获取纳米抗体，筛选特异性纳米抗体的常见手段包括噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示、深度测序等［36］。

2 纳米抗体在自身免疫性疾病中的应用

近年来，靶向多种细胞因子，通过不同通路抑制免疫系统与自身抗原之间的致病性相互作用的新型生物制剂正在逐渐开发［11］。全球有多个研究机构开发了多种形式的纳米抗体，可用于治疗自身免疫性疾病（表1）。

表1 纳米抗体在自身免疫性疾病中的应用Tab.1 Application of nanobody in autoimmune diseases

2.1 获得性血栓性血小板减少性紫癜 血栓性血小板减少性紫癜是一种罕见的急性、危及生命的血栓性微血管病，以微血管病性溶血性贫血、消耗性血小板减少症和器官损伤为特征［37］。先天性血栓性血小板减少性紫癜是ADAMTS13（血管性血友病因子VWF的切割蛋白酶）纯合子或复合杂合子突变的结果，而获得性血栓性血小板减少性紫癜是ADAMTS13严重缺乏引起的一种自身免疫性疾病［38］。获得性血栓性血小板减少性紫癜通常发生在成年期，其患病率为10例/百万，发病率为每年1～2例/百万［39-40］。获得性血栓性血小板减少性紫癜的免疫治疗包括抑制抗ADAMTS13自身抗体产生，以及抑制VWF和血小板之间的相互作用［38］。

Caplacizumab（ALX-0081）是首个被批准上市的纳米抗体药物，用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜［19］。它是一株靶向VWF的A1结构域的双价纳米抗体（图1），在缺乏ADAMTS13蛋白酶的情况下，未切割的超大型VWF多聚体积累并诱导血小板过度结合和激活，导致播散性微血栓形成［40］。Caplacizumab与血小板计数反应时间减少有关，可抑制血小板和VWF多聚物之间的相互作用，减少血小板聚集和微血管血栓形成，降低了疾病的病死率和复发率［39］。Caplacizumab耐受性好，安全性高，最常见的副作用是轻微出血，通常很容易控制，大多数相关出血无需干预就可以解决［38］。在Caplacizumab临床试验中没有死亡或难治性获得性血栓性血小板减少性紫癜复发，相比之下，被批准用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜的抗CD20的嵌合单抗药物Rituximab可能会导致输注反应和乙肝病毒再活化［37］。

图1 用于治疗自身免疫性疾病的纳米抗体示意图Fig.1 Schematic diagram of nanobodies for treatment of autoimmune diseases

2.2 银屑病 银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，影响着全球2.5%的人口，并给患者带来巨大的心理负担［41］。银屑病具有多种表型，症状包括瘙痒、灼烧感和疼痛［42］。在过去的十年中，已经开发出了针对银屑病的高效靶向疗法，即针对IL-17和IL-23的疗法［43］。

M1095（ALX-0761）是一株三价双特异性纳米抗体（图1），相对分子质量为40 kD，包括1个IL-17F特异性的N端部分，1个IL-17A和IL-17F结合的C端部分，以及1个与人血清白蛋白结合的中心构建块，以延长血浆半衰期［41，44］。IL-17与许多人类炎症和自身免疫性疾病的病理有关，如银屑病、类风湿关节炎和多发性硬化。虽然IL-17A是IL-17家族最具特征的成员，但其最接近的亲属IL-17F具有相似的生物活性，甚至可能在体内发挥非冗余作用，两者都以同质二聚体和异质二聚体的形式存在。因此，同时靶向IL-17A和IL-17F可以更有效地阻断炎症反应。在一项随机、双盲、安慰剂对照的1期临床试验中：多重上升剂量皮下注射M1095治疗中重度银屑病，结果显示多次皮下注射M1095对治疗银屑病具有良好的安全性和剂量依赖性［45］。目前，该药物处于2期临床试验阶段［41］。

2.3 类风湿关节炎 类风湿关节炎是一种严重的慢性自身免疫性疾病，影响世界1%的人口［46］。其发病受到环境因素、自身行为因素等多种因素的共同影响［47］。类风湿关节炎不仅影响关节，还会影响内脏器官，甚至造成永久性残疾。非甾体类抗炎药、皮质类固醇和甲氨蝶呤可用于类风湿关节炎的治疗，但会带来严重的副作用［48-49］。

Vobarilizumab（ALX-0061）是一株用于治疗类风湿关节炎的双特异性纳米抗体（图1），相对分子质量为25.7 kD，包含2个人源化和序列优化的可变结构域：抗IL-6R结构域和抗人血清白蛋白结构域。Vobarilizumab单价相互作用消除了IL-6R的交联，抗IL-6受体结构域阻断IL-6与受体的结合，抗人血清白蛋白结构域显著延长了其在血清中的半衰期［50］。多效性细胞因子IL-6在包括类风湿关节炎在内的多种疾病的发病机制中发挥重要作用［51］。IL-6可通过其可溶性受体（sIL-6R）或膜结合型受体（mIL-6R）诱导多种生物活性，与IL-6通路抑制相关的有害药理学与mIL-6R抑制有关。因此，与同等形式的IL-6R抑制相比，优先抑制sIL-6R可以提供更好的治疗效果和更低的副作用［52］。体外实验表明，Vobarilizumab优先与可溶性受体sIL-6R结合，而重组人源化抗IL-6R的单克隆抗体Tocilizumab表现出对mIL-6R的优先活性［53］。ALX-0061优先抑制sIL-6R转信号通路可以提供比Tocilizumab更好的治疗效果和更低的副作用［52］。两者虽然在2期临床试验中均显示出相似的疗效，但使用Vobarilizumab导致的不良事件更少。在一项为期24周的全球双盲2期试验中，研究人员对甲氨蝶呤稳定背景下活动性类风湿性关节炎患者的疗效和安全性进行了评估，结果显示在活动期类风湿关节炎患者中，Vobarilizumab单药治疗对疾病活动度有积极影响［54］。由于Vobarilizumab降低了疾病活动评分并导致了持久缓解的效果，同时最大程度地减少了副作用，研究结果支持将Vobarilizumab推进到3期临床试验。

Ozoralizumab是Ablynx开发的一株人源化三价双特异性纳米抗体（图1），被开发用于治疗类风湿关节炎，其相对分子质量为38 kD。包含3个结构域：2个抗TNF-α结构域和1个抗人血清白蛋白结构域。TNF-α是一种多效细胞因子，在调节免疫反应的炎症级联反应中起核心作用，在细胞和体液免疫的许多方面具有强大的作用［46，55］。在患者的滑膜液和滑膜中已经观察到TNF-α水平的升高。TNF-α由于影响滑膜内的各种细胞，如巨噬细胞、滑膜细胞等，可引起局部炎症和翳形成，导致软骨侵蚀和骨破坏［46］。Ozoralizumab对人类TNF-α显示出很高的亲和力，在细胞基础实验中与etanercept在摩尔基础上显示了同等的效力，优于Adalimumab和Infliximab。药代动力学分析显示，Ozoralizumab在非人灵长类动物体内半衰期较长。Ozoralizumab已完成了1/2期临床试验，试验中既满足了主要终点，也满足了次要终点，且没有任何严重不良事件的报告［56］。2019年10月15日大正制药公司在日本启动了该药物针对类风湿关节炎的扩展3期试验。

2.4 系统性红斑狼疮 系统性红斑狼疮是一种复杂的自身免疫性疾病，主要症状为皮疹、阳光敏感和关节疼痛，高发于育龄妇女［57］。由于早诊早治，患者生存率有显著提高，但是系统性红斑狼疮患者的标准化病死率仍然比一般人群高4.6倍［58］。近几十年来，系统性红斑狼疮的治疗已经从使用羟氯喹、糖皮质激素和常规免疫抑制药物转变为生物制剂，Belimumab是迄今为止唯一一个被批准用于治疗系统性红斑狼疮的生物制剂［57］。

鉴于IL-6在人类系统性红斑狼疮血脑屏障中的B细胞亢进和免疫病理中的重要作用，Vobarilizumab也被试验用于治疗系统性红斑狼疮［11］。Vobarilizumab阻断IL-6R可抑制IL-6级联反应和功能，体外实验已证明它的高亲和力［51］。在评估ALX-0061对系统性红斑狼疮患者的安全性和有效性的2期临床试验结果表明，该药物具有强大的疗效和稳定的安全性。

ATN-192是Ozoralizumab聚乙二醇化制成的药物，特异性靶向TNF-α（图1）［11］。TNF-α是活动性系统性红斑狼疮患者血清中高水平的促炎细胞因子，同时是一种凋亡诱导物，对T细胞、B细胞和树突状细胞的发育有重要作用，与疾病活动度和某些临床表现有关。总之，TNF-α主要通过其促炎活性发挥有害的组织损伤作用，抑制TNF-α可以抑制系统性红斑狼疮的进一步活动［59］。ATN-192的一项针对健康志愿者的1期临床试验已成功完成，目前正在2期临床试验中。

2.5 过敏性哮喘 免疫球蛋白E（IgE）是人类血清中含量最低的抗体亚型。然而，它能引起强烈的过敏反应。IgE与其在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的高亲和力受体FcεRⅠ相互作用是诱导过敏反应的必要条件［60-61］。Omalizumab（一种抗IgE的单克隆抗体）可以竞争性抑制IgE的循环，治疗过敏性哮喘［62］。然而，IgE-FcεRⅠ复合物的解离非常缓慢，这种相互作用不受Omalizumab的影响。ALX-0962是一株双特异性的纳米抗体（图1），包含2个结构域：抗IgE结构域和抗人血清白蛋白结构域。研究表明ALX-0962具有双重作用：中和可溶性IgE，并在体外置换形成的IgE-FcεRⅠ复合物，与Omalizumab相比，可以更快地起效，改善哮喘的早期临床症状。推测ALX-0962与破坏性IgE抑制剂类似，可能比传统的抗IgE分子表现出更快的作用，从而增强治疗效益［63］。该药物目前处于临床试验阶段［64］。

2.6 多发性硬化 多发性硬化是发病于中枢神经系统的炎症性自身免疫性疾病，是年轻人最常见的神经疾病和致残原因，其特征为炎症、脱髓鞘斑块和神经退行性病变［65-66］。趋化性细胞因子也称为趋化因子，在炎症免疫细胞进入中枢神经系统的过程中起着至关重要的作用。临床和实验证据表明，趋化因子CXCL10及其受体CXCR3与多发性硬化发病机制有关［65］。血脑屏障是生物制剂进入大脑的天然屏障，降低了药物在中枢神经系统中的有效浓度［67］。而纳米抗体因其体积小、高溶解性和稳定性以及有效的组织穿透性能，成为了治疗中枢神经系统疾病有潜力的药物［67-68］。3Nb12是一株靶向CXCL10的纳米抗体，可以有效地阻止CXCL10通过CXCR3传递信号，从而抑制细胞趋化性，是治疗多发性硬化候选药物［65］。

2.7 其他自身免疫性疾病 此外，虽然自身免疫性疾病包括许多种类和不同的表型、临床表现，但是它们通常具有一些相似的疾病特征，包括产生自身抗体、细胞因子失调、调节性T细胞失衡等［11，69］。因此目前研究人员不断探索开发新的药物，旨在同时治疗多种自身免疫性疾病，抑制或减少这些自身免疫性疾病常见和共有的病理特征。

IL-23是一种中枢促炎细胞因子，其可通过IL-17和IL-22两臂的正反馈调节作用产生无限炎症循环，在慢性炎症和自身免疫性炎症疾病的发生发展中发挥重要作用［70］。研究人员将多价的靶向IL-23的纳米抗体连接组装在抗人血清白蛋白的纳米抗体两侧，发现与单价纳米抗体相比，多价的IL-23纳米抗体在体外和体内均具有更高的人类IL-23中和能力，这种药物是进一步开发治疗克罗恩病、类风湿关节炎和银屑病极好的候选结构药物［71］。

趋化因子和趋化因子受体在免疫系统稳态中发挥关键作用，控制白细胞和其他造血细胞的激活、分化、迁移和生存。由于趋化因子受体系统在白细胞迁移中的作用，其是一个重要的炎症介质。趋化因子或趋化因子受体长时间或不受控制的表达促进了白细胞异常渗入炎症组织，这可能会导致炎症、自身免疫性疾病或肿瘤生长、生存和转移。研究发现靶向CXCR4和ACKR3的纳米抗体有潜力治疗哮喘、多发性硬化等多种自身免疫性疾病［72］。

3 结论与展望

纳米抗体具有相对分子质量小、易于改造、可避免毒性作用等优点，是非常有前途的自身免疫性疾病的候选治疗分子，易于开发和稳定生产的特点进一步增加了其作为治疗药物的前景。目前，人们已经对大量纳米抗体进行了抗体工程改造，提高了它们的靶标特异性，改进的纳米抗体广泛用于多种疾病的治疗和诊断［73］。

自身免疫性疾病中多种细胞因子及其在免疫细胞上的受体共同驱动炎症反应，其致病机制十分复杂。然而，不同的自身免疫性疾病仍存在一些相同的疾病特征，这提示我们可以针对相关靶点来治疗这些疾病共有的疾病特征，例如靶向IL-6R的纳米抗体可能可以同时治疗类风湿关节炎和系统性红斑狼疮；多价的纳米抗体可以增强亲和力和特异性，例如多价的靶向IL-23纳米抗体具有更高的IL-23中和能力，有潜力治疗多种自身免疫性疾病。

与此同时，纳米抗体易于改造，通过抗体工程技术连接可以获得具有多种特异性的分子。可以开发同时针对一个或多个促炎细胞因子或细胞因子受体的纳米抗体，例如IL-17A和IL-17F，通过多种通路抑制免疫系统与自身抗原之间的致病性相互作用。结合纳米抗体双功能融合蛋白中额外的靶向特定器官或细胞因子的片段或模块，不仅可以延长抗体在体内的半衰期，还可以选择性地抑制致病的细胞因子，而不影响正常功能［74］。

综上所述，开发靶向一个促炎细胞因子或细胞因子受体的多价纳米抗体或同时靶向多个促炎细胞因子或细胞因子受体的多特异性纳米抗体是开发治疗自身免疫性疾病的药物最有潜力的方向之一。