TREM2单克隆抗体的制备及应用检测

马宾 孟麟 戎卓娜 赵传科 寿成超

（北京大学临床肿瘤学院，北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所，生物化学与分子生物学研究室，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京100142）

髓系细胞触发受体2（triggering receptors expressed on myeloid cells 2，TREM2）是免疫抑制受体，属于免疫球蛋白超家族。TREM2基因位于人类染色体6p21.1上，由5个外显子组成，编码TREM2蛋白，包含230个氨基酸［1］。研究表明，TREM2在部分髓系细胞膜上表达，主要包括树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、破骨细胞和小胶质细胞等。其结构由以下4个区域组成：信号肽序列、细胞外Ⅴ型免疫球蛋白结构域及一个短柄序列、单次跨膜结构域、胞内的短尾区［2］。除了膜结合形式外，TREM2还能以可溶性形式释放［3-4］。

TREM2在多种生命活动中发挥重要作用，包括细胞成熟、细胞增殖、细胞存活、吞噬和炎症调节等［5］。这一系列不同的功能主要由TREM2和多种潜在的配体相互作用调节，这些配体包括大量的阴离子分子，如革兰阳性和革兰阴性细菌（淋球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）、DNA、脂蛋白和磷脂等［6］。TREM2通过其跨膜结构域中相反的电荷残基与其适配器DAP12、DAP10结合。当配体与膜上的TREM2结合后，这些共受体被磷酸化并招募下游的信号转导分子，从而发挥不同的生物学效应［7］。

TREM2对于维持小胶质细胞的代谢适应性至关重要，因此以往对TREM2的研究主要集中在神经退行性疾病中。如在阿尔茨海默病中，TREM2发生突变产生变异体，导致TREM2功能丧失，因而小胶质细胞不能聚集在Aβ斑块周围。斑块周围的小胶质细胞是形成物理屏障的必要条件，可以限制斑块的扩散，保护周围的神经元免受斑块神经毒性的影响［8］。近些年越来越多的研究开始关注TREM2在肿瘤相关巨噬细胞和髓系源性抑制细胞中的作用。最近的一项研究发现，与健康对照组相比，TREM2在肺癌患者和荷瘤小鼠的外周血单核细胞以及肿瘤相关巨噬细胞上表达显著升高。肿瘤相关巨噬细胞的TREM2水平与肿瘤进展呈正相关［9］。MOLGORA等［10］2020年发表在Cell上的一篇文章证明，与野生型小鼠相比，TREM2基因缺陷型小鼠更能抵抗各种肿瘤的生长，并且抗PD-1免疫疗法对前者疗效更好。此外，与单独使用PD-1抗体治疗相比，TREM2抗体与PD-1抗体联合应用可以更有效地抑制小鼠移植瘤生长。因此TREM2抗体药物有望与其他检查点阻断药物联合应用，提高抗肿瘤免疫疗法的疗效。

1 材料与方法

1.1 材料 PUC-SP-TREM1、PUC-SP-TREM2质粒由上海生工生物技术有限公司全基因合成。BL21大肠杆菌感受态以及原核表达载体pGEX-4T-1由生化室保存，限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、T4 DNA连接酶购于NEB公司。6～8周龄BALB/c小鼠购于北京维通利华实验动物中心，小鼠SP2/0骨髓瘤细胞系由生化室保存，培养条件为RPMI1640+15%FBS。水溶性佐剂购自北京博奥龙免疫技术有限公司；TREM1真核表达蛋白（Cat#.HPLC-10511-H08H）购于义翘神州公司；TREM2真核表达蛋白（Cat#.TR2-H52H5）购于ACRO公司；TREM1抗体（Cat#.AF1278-SP）购于RD公司；TREM2抗体（Cat#.91068）购于CST公司；His tag抗体（Cat#.ab1187）购于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 pGEX-4T1-TREM2重组质粒构建 选取人TREM2胞外段作为免疫原片段（编码TREM2的第1～174位氨基酸序列）。该基因片段长度为522 bp，通过PCR扩增获得。设计正向引物序列为：5'-CGGGATCCATGGAGCCTCTCCGGCTGCTC-3'，反向引物序列为：5'-CGGAATTCTCAGGAAGTGGGTGGGAAGGGGATTTCT-3'。引物由上海擎科生物科技有限公司合成。以PUC-SP-TREM2质粒DNA为模板进行PCR扩增；PCR产物及pGEX-4T-1质粒分别经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，电泳、胶回收目的片段及载体片段，二者经T4 DNA连接酶在4 ℃静置连接过夜。次日将连接产物常规转染大肠杆菌，37 ℃培养过夜，少量提取质粒后进行测序鉴定。

1.2.2 GST-TREM2融合蛋白的诱导表达及纯化将测序结果正确的重组菌稀释到200 ml LB培养基中，37 ℃、225 r/min培养至OD600nm为0.7左右，加入0.25 mmol/L IPTG，继续培养4 h。6 000 r/min离心10 min后弃上清，加入10 ml细菌裂解液，充分悬浮细菌沉淀。室温静置10 min后加入终浓度为1%TritonX-100，冰浴20 min后进行超声裂解；裂解液4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取沉淀。在细菌沉淀中加入10 ml 2%去氧胆酸钠，冰上超声50 s，室温振摇30 min，10 000 g离心10 min，弃上清。沉淀中加入500 μl变性液，室温变性3 h，液体变清亮后离心弃沉淀。上清液加入9倍体积的复性液，室温复性1 h，4 ℃复性4 h。离心后取上清用25 mmol/L Tris-HCl透析过夜，期间换液3次，次日用蔗糖包埋浓缩；10%SDS-PAGE检测其含量和纯度。

1.2.3 动物免疫 将纯化的GST-TREM2融合蛋白与等体积的水溶性佐剂充分混合，小鼠双侧下肢注射融合蛋白，40 μg/只。初次免疫3周后用同样的方法进行第2次免疫，第2次免疫后14 d采尾静脉血，ELISA测血清抗体效价。融合前4 d选择抗体滴度高的小鼠进行融合前加强免疫。

1.2.4 293T-TREM1、293T-TREM2稳转细胞系的构建 将委托公司合成的PUC-SP-TREM1、PUC-SPTREM2质粒进行双酶切，酶切位点为EcoRⅠ和BamHⅠ。将酶切回收的目的片段构建到真核表达载体pLVx上，获得pLVx-TREM1和pLVx-TREM2重组质粒。分别用上述质粒转染293T细胞。转染48 h后更换为含1 μg/ml嘌呤霉素的完全培养基进行筛选培养，至上清中无死细胞后，收集细胞总蛋白进行目的蛋白检测。

1.2.5 细胞融合与筛选 取加强免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合，融合后第8天左右，将293T、293T-TREM1及293T-TREM2细胞以2×104个/孔铺96孔板，克隆孔培养上清作为一抗，进行常规细胞ELISA检测，筛选出与293T-TREM2细胞反应、与293T及293T-TREM1均不反应的克隆孔，进行3～5次亚克隆及筛选，直至获得能稳定分泌抗TREM2抗体的单克隆杂交瘤细胞株。

1.2.6 单克隆抗体的制备与纯化 BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，0.5 ml/只，次日腹腔注射杂交瘤细胞2×106个/只。约10 d后收取腹水，10 000 r/min离心5 min，取上清。用PBS等体积稀释腹水上清，0.45 μm滤器过滤，Protein G凝胶柱进行纯化；纯化抗体经PBS充分透析后，用SDS-PAGE电泳鉴定抗体纯度和含量。

1.2.7 ELISA 293T、293T-TREM1、293T-TREM2细胞铺于96孔板（2×104个/孔），培养过夜，细胞融合度达到80%左右时，加入0.25%的戊二醛，室温固定30 min，PBST洗4遍；5%脱脂牛奶室温封闭2 h，PBST洗4遍。将稀释的小鼠血清或单抗作为一抗，室温反应2 h，PBST洗4遍。HPR标记的羊抗小鼠IgG作为二抗，室温反应1 h，PBST洗4遍。加入OPD，室温避光显色15 min。12.5%H2SO4终止反应，检测OD490nm读数。

1.2.8 流式细胞术 消化细胞，PBS清洗2遍。每个体系取2×105个细胞，加2 μg/ml自制TREM2单抗室温反应45 min，PBS洗2遍，Alexa Fluor 488标记的羊抗鼠IgG作为二抗，室温染色30 min，PBS洗2遍，100 μl PBS重悬细胞，上机进行检测。

1.2.9 蛋白免疫印迹 用RIPA裂解液分别裂解293T、293T-TREM1、293T-TREM2细胞收集蛋白。每泳道上样20 μg。SDS-PAGE后，300 mA转膜50 min。5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，分别用自制TREM2单抗（2 μg/ml） 4 ℃孵育过夜。次日洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶2 000），室温孵育50 min，ECL化学发光显色。

1.2.10 免疫沉淀 各取2 μg自制TREM2单抗与20 μl Protein G加到1 ml PBST中，同时以2 μg小鼠IgG作为阴性对照，在摇床上室温孵育1 h，PBST洗3遍，之后分别加入30 ng TREM1、TREM2真核蛋白和900 μl PBST，4 ℃结合过夜。次日PBST洗3次，弃上清，珠子中加入等体积的2×SDS裂解液，电泳90 min、300 mA转膜50 min，牛奶封闭后用HRP标记的His抗体进行检测。

1.2.11 免疫荧光实验 预先乙醇浸泡直径1 cm的圆形细胞爬片，晾干后在24孔板里每孔放1个爬片。293T、293T-TREM1、293T-TREM2细胞消化重悬，以相同细胞数铺在24孔板中。细胞贴壁24 h后，预冷PBS洗2遍，2 μg/ml自制TREM2单抗室温反应1 h，PBS洗3遍；Alexa Fluor 594标记的羊抗鼠IgG室温避光染色30 min，PBS洗3遍，DAPI复染细胞核，90%甘油封片后用共聚焦显微镜进行拍照。

2 结果

2.1 TREM2胞外段融合蛋白的诱导表达和纯化测序正确的重组质粒转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达，超声裂解后行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测。结果可见重组质粒转染的细菌经诱导表达后有目的蛋白表达，主要以包涵体的形式存在于细菌沉淀中（图1A）。包涵体经蛋白变复性纯化后，进行电泳鉴定，在约42 kD处可见目的蛋白条带，但在35 kD上下位置也有较明显的蛋白条带，可能系目的蛋白降解所致（图1B）。

图1 融合蛋白表达、纯化及TREM过表达细胞系鉴定Fig.1 Expression， purification of fusion proteins and identification of cell lines overexpressing TREM

2.2 TREM过表达细胞系鉴定 将PUC57-TREM1及PUC57-TREM2质粒进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切获得目的片段，然后将其插入真核表达载体pLVx中。酶切后电泳结果表明，质粒释放出的载体片段和目的蛋白表达片段大小与预期相符（图1C、D）。质粒进行Sanger测序，测序结果与目的片段序列比对结果一致（测序结果未展示）。对经pLVx-TREM1或pLVx-TREM2质粒转染并建株的293T-TREM1和293T-TREM2总蛋白进行Western blot检测表明，TREM1和TREM2分别在293T-TREM1和293TTREM2细胞中成功表达（图1E）。

2.3 小鼠免疫与TREM2单抗杂交瘤株的筛选 采用293T和293T-TREM2细胞，对上述融合蛋白GSTTREM2二次免疫后小鼠的抗血清效价进行ELISA检测。结果表明，在免疫的4只小鼠中，3只小鼠的抗血清与293T-TREM2细胞呈较强特异反应。选取抗血清效价最高的小鼠进行加强免疫及融合筛选。融合后细胞共接种16块96孔培养板，融合率为100%。采用293T、293T-TREM1和293T-TREM2细胞对杂交瘤细胞的培养上清进行ELISA检测，选取杂交瘤上清与293T-TREM2细胞反应值是与293T、293T-TREM1细胞反应读值3倍以上的克隆作为初筛阳性克隆；对100个阳性克隆进行亚克隆，3～5次亚克隆及筛选后，最终构建了58个阳性克隆。用阳性克隆作为一抗进行ELISA反应，结果见图2。

图2 TREM2单抗杂交瘤细胞株筛选Fig.2 Screening of hybridoma cell lines of TREM2 monoclonal antibody

2.4 TREM2单抗的制备、纯化 根据杂交瘤上清与293T-TREM2的结合特异性，挑选了29株杂交瘤细胞（TM1、TM2……TM29），制备小鼠腹水并用Protein G对腹水进行纯化，SDS-PAGE电泳检测抗体纯度。如图3所示，所获得的抗体在SDS-PAGE凝胶电泳中只分别在55 kD和25 kD左右可见重、轻链两条条带，无其他杂带，抗体纯度＞95%。

图3 TREM2单克隆抗体的纯化Fig.3 Purification of TREM2 monoclonal antibodies

2.5 ELISA检测单克隆抗体特异性及亲和力 在获得纯化抗体后，通过细胞ELISA对抗体的结合特异性进行了进一步检测，结果表明，在29株纯化抗体中，除5株抗体（TM6、TM8、TM10、TM22、TM26）与293T-TREM1和293T亲本细胞有一定交叉反应外，其余24株单抗均只与293T-TREM2细胞呈特异性结合反应，与293T-TREM1和293T亲本细胞不反应。在此基础上，用细胞ELISA检测了抗体的亲和力，结果可见（图4）29株抗体与293T-TREM2细胞均具有较高的结合活性，且呈现剂量依赖性。除TM6、TM8、TM10和TM20外，其余抗体均呈现较明显的S型结合曲线。所有抗体的EC50均为nmol，表明获得的TREM2单抗亲和力均较高（表1）。

表1 TREM2单克隆抗体的亲和力Tab.1 Affinity of TREM2 monoclonal antibodies

图4 ELISA检测TREM2单克隆抗体的亲和力Fig.4 Affinity of monoclonal antibodies reacted with TREM2 protein by ELISA

2.6 TREM2单克隆抗体在Western blot中的应用检测 为了解获得的抗体是否可用于TREM2的Western blot检测及其抗体特异性，分别用293T、293T-TREM1和293T-TREM2细胞总蛋白进行电泳（上样量均为20 μg）、转膜后，用上述29株抗TREM2单克隆抗体作为一抗进行Western blot检测。结果显示，29株抗体均在293T-TREM2细胞总蛋白中检测到特异性的TREM2条带，而与293T、293T-TREM1细胞总蛋白无结合条带（图5），说明获得的TREM2单抗具有较好的TREM2结合特异性，且均能用于Western blot检测。

图5 TREM2单克隆抗体Western blot应用Fig.5 Western blot application of TREM2 monoclonal antibodies

2.7 TREM2单克隆抗体在免疫沉淀中的应用检测 为了明确自制单抗能否用于IP及抗体特异性检测，用29株TREM2单抗分别与真核表达蛋白His-TREM1和His-TREM2进行免疫沉淀，用抗His抗体进行Western blot检测。如图6所示，所有单抗均与TREM2呈特异性反应，与TREM1蛋白不反应；单抗TM4、TM5、TM7、TM14、TM15、TM16、TM17、TM19的阳性信号较弱，表明其与TREM2结合能力较弱，其余单克隆抗体表现出较强的结合能力。

图6 TREM2单克隆抗体免疫沉淀应用Fig.6 Immunoprecipitation application of TREM2 monoclonal antibodies

2.8 TREM2单克隆抗体在流式细胞术中的应用检测 采用纯化抗体对293T、293T-TREM1和293TTREM2细胞进行流式检测表明，29株抗体均与TREM2呈特异性反应，而与293T和293T-TREM1细胞基本不反应。根据MFI的统计结果可见，除TM1、TM11和TM13的MFI值相对较低外，其余抗体的MFI值较高，说明TREM2单抗与TREM2有较强结合（图7）。

图7 流式检测鉴定TREM2单抗特异性的MFI统计图Fig.7 Flow cytometry was used to identify specific MFI of TREM2 monoclonal antibody

2.9 TREM2单克隆抗体在细胞免疫荧光中的应用检测 根据以上检测结果，选择TM5、TM7、TM12、TM14、TM20、TM25共6株抗体进行免疫荧光应用检测。结果如图8所示，受测的六株抗体均能与293TTREM2细胞特异性结合且呈膜定位，而与293T和293T-TREM1细胞均不反应，说明该6株抗体均可用于TREM2的特异性免疫荧光检测。

图8 TREM2单克隆抗体的免疫荧光应用Fig.8 Immunofluorescence application of TREM2 monoclonal antibodies

3 讨论

单克隆抗体制备技术是现代生命科学研究的重要手段之一，随着分子生物学和细胞生物学的发展，单克隆抗体制备技术也不断发展完善，传统的小鼠杂交瘤抗体制备技术因其技术成熟、操作相对简单及条件要求较低等优势，仍然是目前获得单克隆抗体的常用方法［11-12］。随着基因工程技术的快速发展，鼠源抗体的人源化改造技术也已经非常成熟。先制备鼠源抗体，再通过基因重组获得人源化抗体，依然是目前抗体药物研发的常用技术途径［13］。

肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）是肿瘤微环境中的主要免疫细胞。近年研究表明，表达于TAM的TREM2作为免疫抑制性受体，在肿瘤免疫逃逸中发挥了重要作用，是肿瘤免疫治疗的又一潜在重要靶点［10，14-15］。为制备获得TREM2特异性单克隆抗体，为后续抗体药物的研发奠定基础，本课题组设计了蛋白和质粒DNA，作为免疫小鼠的不同策略。但在用质粒作为抗原免疫的小鼠中，通过对血清效价进行检测，未检测到小鼠产生的抗TREM2抗体，其原因可能是经尾静脉注射的DNA未能在小鼠体内有效表达导致不能激发小鼠对TREM2的免疫反应。在制备抗原蛋白GST-TREM2时，因其表达在大肠杆菌的包涵体中，通过蛋白变复性纯化，虽然获得的GST-TREM2蛋白纯度不高（其中包括融合蛋白的降解产物），但用293T-TREM2细胞对抗血清效价进行检测表明，小鼠对TREM2产生了有效的免疫反应。在融合后的首轮筛选中，先用293T和293T-TREM2细胞进行初筛，选取只与293T-TREM2细胞反应的进行克隆，用293T-TREM1和293T-TREM2细胞进行复筛，对仍与293T-TREM2细胞呈特异反应的克隆，通过后续的多轮亚克隆筛选，最终建立了58个阳性克隆株。选取其中29株进行抗体制备及细胞ELISA检测，发现其中的24株可与TREM2特异性结合；通过ELISA对抗体亲和力的初步检测表明，所获抗体的亲和力都在nmol以上，表明抗体与抗原有较强结合力。为了解所获抗体在不同免疫学实验中的应用及对抗体特异性进一步验证，对抗体进行了Western blot、免疫沉淀、流式细胞术和免疫荧光等检测，结果表明不论TREM2蛋白是否变性，它们均能与TREM2特异反应，可用于不同免疫学实验。同时表明抗体结合的表位为TREM2的一级肽链序列，而非蛋白的空间结构。

综上，本研究获得了多株TREM2特异性单克隆抗体，它们有较强的结合活性，并可用于不同免疫学实验。在后续研究中，本课题组将评估所获抗体对髓系细胞尤其是巨噬细胞极化和免疫功能的激活作用，并进一步探索其发挥作用的分子机制，为TREM2抗体药物的研发提供依据。