丹酚酸B对帕金森病小鼠肠功能紊乱的保护作用及机制研究

南亚强 陶计委 周杰，2 范斐阳 蒋谷峰 朱彤 曾广红

（1.兰州大学第二临床医学院，兰州730050； 2.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院，兰州 730050）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是发生于中老年人群常见的神经退行性疾病，其病因与年龄、性别、种族、遗传、环境、饮食等多项因素相关。PD临床症状主要为静止性震颤、运动徐缓、肌强直以及姿势步态异常等经典的运动症状，临床研究证实PD患者同时伴有诸多非运动症状，包括：情感认知缺陷、视听嗅及躯体感知感觉异常、精神障碍、睡眠障碍、自主神经功能紊乱、胃肠道功能紊乱和膀胱功能障碍等［1］。近年诸多研究表明PD发生发展可能与包括胃肠道感染、肠道菌群失调、炎症性肠病、小肠细菌过度生长及胃肠道黏膜免疫功能紊乱等相关的肠道炎症（gastrointestinal inflammation，GI）密切相关［2］。国内外研究证明Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路在促进PD发生发展的病理进程中起重要作用［3-4］。

丹参是临床用于治疗PD的重要中药材，其作为补肾活血方、复方地黄方等中药方剂的主要成分在PD临床治疗中取得良好疗效［5-7］。丹酚酸B（Salvianolic acid B，SalB）在丹参中的含量最高，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性，SalB可通过抑制α-突触核蛋白积聚、抑制小胶质细胞介导的炎症因子释放、降低细胞活性氧水平减轻氧化应激损伤、维持线粒体功能稳定等途径在PD动物或细胞模型中发挥神经保护作用［8-12］。近年来研究显示，在心肌缺血性损伤及缺血性卒中等疾病中，SalB可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路发挥抗炎作用［13-14］。但SalB对PD模型小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及肠道功能的影响尚未见报道。本研究采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrah-ydropyridine，MPTP）诱导C57BL/6小鼠构建PD动物模型，通过行为学实验、病理及分子生物学等实验检测，探讨SalB对MPTP诱导的PD小鼠模型的神经及肠道保护作用，并基于TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 48只雄性C57BL/6小鼠，10～12周龄，体质量20～25 g，购自中国农业科学院兰州兽研所，许可证号：SCXK（甘）2015-0001。实验操作流程严格遵循中国实验动物操作指南，经过中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院伦理委员会批准（审批编号：2021kyll089）。实验动物在标准实验动物房内［相对湿度：40%～60%，室温：（23±1）℃］自由进食和饮水。

1.1.2 试剂与仪器 MPTP、SalB购于北京索莱宝科技有限公司；GAPDH、ZO-1抗体购于英国Abcam公司；TLR4抗体、酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）抗体购于美国Peprotech公司；β-actin、H3抗体、MyD88抗体、NF-κB p65抗体及HRP标记的羊抗兔二抗购于北京博奥森生物技术有限公司；p-NF-κB p65抗体购于Cell signaling technology公司；TNF-α（最低检测浓度小于0.1 pg/ml）、CP（最低检测浓度小于0.1 pg/ml）试剂盒购于江苏酶标生物科技有限公司。BX51正置显微镜购自日本Olympus公司；SDS-PAGE电泳装置及ChemiDocMPImaging System购于美国Bio-Rad公司；高速冷冻离心机购于德国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型构建 48只雄性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组（Control）、SalB对照组（SalB）、MPTP组（MPTP）、SalB治疗组（MPTP+SalB），每组12只。小鼠适应环境、爬杆训练1周后建模给药；MPTP组及SalB治疗给予30 mg/（kg·d）MPTP腹腔注射，连续5 d［15］；同时Control组、SalB组腹腔注射等量生理盐水。造模成功后，SalB组及MPTP+SalB组小鼠腹腔注射50 mg/（kg·d）SalB，2次/d，连续7 d［10］，对照组和模型组同时腹腔注射等量生理盐水，给药结束后对各组小鼠进行行为学测定和肠道功能评估，并采集标本。

1.2.2 爬杆实验 小鼠头朝上，双前爪放在杆顶端圆球上（高55 cm，杆直径1 cm，圆球直径2 cm）。小鼠从放置到头部朝下的时间为掉头转弯时间，从放置顶端爬到双后爪着地时间为爬杆总时间，3次/只，取平均值。

1.2.3 粪便含水量测定 小鼠于实验前一晚20：00开始禁食不禁水12 h，次日上午8：00给予小鼠喂食，2 h后开始测试，小鼠按照每笼1只进行分放，2 h后收集粪便，即刻计数小鼠粪便粒数并称重，最后将收集粪便于65 ℃烤箱中烤干称重并计算含水量。

1.2.4 胃肠蠕动功能测定 小鼠禁食不禁水12 h，小鼠按照每笼1只分放，5%活性炭悬液10 ml/kg灌胃1次，灌胃后开始喂食并即刻计时，观察并记录第一粒黑色粪便排出时间。

1.2.5 取材 所有测试结束后用10%水合氯醛麻醉取材，每组取6只小鼠用4%多聚甲醛行心脏灌注固定取完整脑组织及结肠，行免疫组化实验；每组取6只小鼠麻醉后分离包括黑质部分的中脑组织及结肠组织，行ELISA和Western blot实验。

1.2.6 HE染色 将固定好的结肠组织进行石蜡包埋切片，切片进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，浸入苏木素中染色20 min，流动自来水中缓慢冲洗15 min，将变蓝的切片浸入酸性分化液10 s，流水清洗3 min后伊红溶液染色3 min，流动自来水缓慢冲洗至切片变为蓝色，最后纯水中静置3 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.7 免疫组织化学实验 将固定好的中脑及结肠组织进行石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后抗原修复10 min，PBS洗3次，每次3 min，内源性过氧化物酶阻断10 min，PBS洗3次，10 min/次，非特异染色阻断剂孵育10 min，加一抗（TH 1∶500；TLR4 1∶200） 4 ℃孵育过夜；第2天，PBS洗3次×3 min，生物素标记的羊抗小鼠/兔IgG聚合物孵育10 min，PBS洗3次×3 min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶孵育10 min，显微镜下DAB显色，苏木素复染，返蓝，乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察并采集图像，利用Image J软件统计分析TH染色阳性细胞数目及TLR4平均光密度。

1.2.8 ELISA检测结肠组织肠CP及TNF-α水平按照TNF-α及CP测定试剂盒说明书进行操作。

1.2.9 Western blot检测中脑TH、结肠TH、ZO-1、TLR4、MyD88、Nuclear NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平 取小鼠黑质部分的脑组织及小鼠结肠组织，加入含PMSF及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液匀浆后，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度；SDS-PAGE电泳分离蛋白，分离胶浓度根据蛋白分子量选择。将分离的蛋白转移至0.22 μm的PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭120 min，相应一抗（TH 1∶1 000，TLR4 1∶500，MyD88 1∶500，p-NF-κBp65 1∶500，Nuclear NF-κB p65 1∶500，β-actin 1∶2 000，ZO-1 1∶1 000，H3 1∶1 000，GAPDH 1∶2 000）4 ℃冰箱摇床孵育过夜。次日TBST清洗3次后，将目标条带与对应种属的二抗室温孵育2 h，TBST清洗3次后曝光，Image J软件分析相应条带灰度值。

1.2.10 结肠黏膜病理损伤评分 按照参考文献［16］的方法对小鼠结肠黏膜病理损伤情况进行评分。

1.3 统计学处理 使用SPSS20.0、GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，组内进一步两两比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SalB对PD小鼠行为学的影响 爬杆实验结果显示，与Control组相比，MPTP组小鼠的转弯时间及爬杆时间延长（P＜0.05，P＜0.05）；与MPTP组相比，MPTP+SalB组转弯及爬杆时间缩短（P＜0.05，P＜0.05，图1）。

图1 各组小鼠爬杆、转弯时间比较Fig.1 Comparison of climbing time， T-turn time of mice in each group

2.2 SalB对PD小鼠肠道功能紊乱影响 与Control组相比，MPTP组小鼠首粒黑便排出时间延长、粪便含水量减少（P＜0.05，P＜0.05）；与MPTP组相比，MPTP+SalB组首粒黑便排出时间缩短、粪便含水量增加（P＜0.05，P＜0.05，图2）。

图2 各组小鼠首粒黑便排出时间、粪便含水量比较Fig.2 Comparison of discharge time of first black stool and water content of feces in each group

2.3 SalB对PD小鼠中脑黑质区域TH阳性神经元及TH蛋白表达水平的影响 免疫组化及Western blot结果显示，与Control组相比，MPTP组小鼠中脑黑质区域TH阳性神经元数目减少（P＜0.05），中脑TH蛋白表达降低（P＜0.05），SalB组中脑黑质区域TH阳性神经元数目增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与MPTP组相比，MPTP+SalB组小鼠TH阳性神经元数量增多（P＜0.05），中脑TH蛋白表达增加（P＜0.05，图3）。

图3 各组小鼠中脑黑质区域TH表达比较（×400）Fig.3 Comparison of TH expression in midbrain of mice in each group（×400）

2.4 HE染色评估PD小鼠结肠病理损伤程度 HE染色结果显示，Control组、SalB组小鼠结肠上皮黏膜完整，黏膜表层上皮细胞内无淋巴细胞浸润，杯状细胞排列整齐，无水肿、溃疡，隐窝结构规则，无分支、扭曲及萎缩；MPTP组小鼠结肠上皮细胞黏膜破坏，局部水肿、溃烂，肠屏障完整性受损，黏膜表层大量炎症细胞浸润，腺体细胞排列不规则，隐窝结构不规则，局部扭曲，萎缩；MPTP+SalB组小鼠结肠上皮细胞黏膜水肿、溃烂较MPTP组减轻。MPTP组结肠黏膜病理损伤评分高于Control组（P＜0.05）；与MPTP组相比，MPTP+SalB组结肠黏膜病理损伤评分显著下降（P＜0.05，图4）。

图4 结肠HE染色结果及结肠黏膜病理损伤评分（×200）Fig.4 HE staining and pathological score of colon （×200）

2.5 SalB对PD小鼠结肠CP及TNF-α表达水平的影响 ELISA结果显示，与Control组相比，MPTP组小鼠结肠CP和TNF-α水平均升高（P＜0.05，P＜0.05）；与MPTP组相比，而MPTP+SalB组小鼠结肠CP、TNF-α含量均显著下降（P＜0.05，P＜0.05，图5）。

图5 小鼠结肠CP和TNF-α比较Fig.5 Comparison of expression levels of CP and TNF-α in colon of mice

2.6 SalB对PD小鼠结肠ZO-1及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达水平的影响 免疫组化结果显示：与Control组相比，MPTP组小鼠结肠TLR4阳性细胞数量明显增加（P＜0.05），SalB治疗后结肠TLR4阳性细胞数量显著下降（P＜0.05）。Western blot结果显示，与Control组相比，MPTP组小鼠结肠ZO-1蛋白表达下降，结肠TLR4、MyD88、Nuclear NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白表达均明显增加（均P＜0.05）；与MPTP组比较，MPTP+SalB组小鼠结肠ZO-1蛋白表达增加，结肠TLR4、MyD88、Nuclear NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白表达均明显减少（均P＜0.05，图6）。

图6 各组结肠ZO-1及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关蛋白表达比较（×400）Fig.6 Comparison of expressions of ZO-1 and TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway related proteins in colon （×400）

3 讨论

PD是与年龄密切相关的难以治疗的神经退行性疾病，其发病机制尚不明确，目前各种治疗措施仅能改善或缓解临床症状，尚无有效药物阻止或延缓其病理进展。中医学理论认为PD的基本病机为肝肾阴虚、肝风内动、筋脉失养，治疗应以补益肝肾、调补气血配伍活血化瘀为主，因丹参具有通络止痉，滋补肝肾的功效，诸多治疗PD的经方中均配伍丹参［17］。SalB是丹参中含量丰富，生物活性最强的水溶性化合物，《中国药典（2015版）》将SalB确定为鉴定丹参品质的标志成分。SalB可通过抗炎、抗氧化、调节肠道菌群等多种途径对神经退行性疾病发挥神经保护作用［18-19］。基于脑-肠轴防治PD是近年的研究热点，肠道和大脑之间存在双向的生物信息交流，胃肠道的生理功能受局部肠神经系统（enteric nervous system，ENS）和中枢神经系统调控，同时肠内产生的神经递质、免疫信号分子、激素和神经肽反过来又会影响大脑［20-21］。本研究观察到腹腔注射SalB可以显著缩短MPTP诱导的PD小鼠爬杆时间及转头时间，缓解了PD小鼠的运动功能障碍；同时SalB有效减少了首粒黑便排出时间，提高了粪便含水量，缓解了PD小鼠胃肠排空延迟及便秘等肠道功能障碍，SalB对MPTP诱导的PD模型的运动功能障碍及胃肠功能障碍具有改善作用。

PD运动症状主要为黑质多巴胺能神经元变性致使纹状体内多巴胺（Dopamine，DA）水平降低而导致，而TH是DA合成的限速酶［22］。本研究发现PD模型组小鼠中脑黑质TH阳性细胞数量显著减少，TH蛋白含量明显下降，SalB促进了PD小鼠黑质残存DA神经元胞内TH的表达，说明SalB可有效减少PD小鼠黑质部多巴胺能神经元变性丢失，对MPTP诱导的PD小鼠具有神经保护作用。肠道中的ENS、肠黏膜上皮细胞等可产生DA，肠道肌层、肌间神经丛以及上皮细胞中均分布有DA受体，肠道中的TH是肠道内DA、去甲肾上腺素等儿茶酚胺类活性物质合成的关键酶，肠道内儿茶酚胺类活性物质水平的下降可引起结肠动力功能障碍［23］。本研究发现SalB有效抑制了PD小鼠结肠组织中TH蛋白表达水平下降，改善了PD小鼠的胃肠功能障碍，对PD小鼠具有肠道保护作用。

肠屏障功能紊乱、GI、肠道微生物紊乱及肠道内微生物代谢产物均影响PD的病理生理过程肠黏膜屏障缺陷使得肠通透性增加，导致了PD肠道炎症发生，肠道炎症是PD发生发展的重要推手，PD患者中枢及外周TNF-α、IL-6等促炎因子均呈高表达，粪便及肠道中CP升高被视为PD早期阶段肠道免疫系统激活的重要指标［24-25］；紧密连接是血脑屏障、肠黏膜屏障等主要组织黏膜屏障的重要结构，ZO-1作为跨膜蛋白与其同源体ZO-2、ZO-3是构成肠紧密连接的主要成分［26］。本研究通过对PD模型小鼠结肠进行HE染色、结肠黏膜病理损伤评分发现小鼠肠黏膜存在明显病理性改变，PD小鼠肠道黏膜炎症细胞聚集，肠黏膜水肿、溃烂，肠黏膜失去完整性，黏膜损伤评分显著增加，进一步免疫印迹实验证实PD小鼠结肠组织ZO-1蛋白表达明显减少、结肠组织CP及TNF-α含量升高，SalB明显减轻上述病理损伤，表明SalB可通过保持肠黏膜屏障完整性、减轻GI反应等肠道病理损伤发挥对PD小鼠的肠道保护作用。

TLR4/MyD88/NF-κB信号通路是机体重要的炎症信号通路，GI导致的肠黏膜屏障破坏及肠黏膜屏障破坏后导致通透性增加引起更为严重的炎症反应，尤其是肠道内TNF-α、脂多糖等激活TLR4相关信号通路，TLR4激活后可通过MyD88依赖性通路或MyD88非依赖性通路激活下游NF-κB，促进NF-κB活化并发生核转移，活化后的NF-κB最终需转移至细胞核进一步启动炎症因子的合成释放，TNF-α、IL-1β等促炎因子是NF-κB主要下游信号因子，而肠道促炎因子又可以通过放大炎症效应进一步正反馈作用于TLR4/MyD88/NF-κB炎症通路，TLR4在PD患者结肠也呈高表达状态［4，27-28］。本研究发现SalB对正常生理状态下的TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白无显著影响，MPTP诱导的PD模型肠道组织中TLR4被激活，其下游分子信号蛋白MyD88高表达，进一步促进NF-κB活化，总的活化NF-κB p65包括Nuclear NF-κB p65和p-NF-κB p65，p-NF-κB p65作为NF-κB活化过程中的一种中间形态，活化后的NF-κB最终转移至细胞核，SalB显著降低了炎症级联效应相关的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的蛋白水平，具体为信号通路中TLR4和MyD88 蛋白含量均减低，p-NF-κB p65磷酸化水平降低，Nuclear NF-κB p65核穿梭减少。本研究表明SalB可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号转导对PD发挥肠道保护作用，其机制可能包括：SalB可能直接或间接抑制了TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的信号转导，SalB直接或间接抑制了TLR4/MyD88/NF-κB通路中分子蛋白表达或NF-κB磷酸化、NF-κB核穿梭，从而直接或间接发挥抗炎作用；此外，SalB可能通过提高肠黏膜屏障而改善GI反应，降低了肠道内TNF-α等TLR4的配体水平，从而缓解了TLR4的激活，使得下游相关分子信号处于静息状态。SalB可通过增强组织细胞抗氧化应激抑制肠道炎症反应，氧化应激与炎症反应相辅相成［29］。因此，SalB抑或通过影响氧化应激系统相关的其他生物信号通路改善了GI，SalB除下调TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白表达外，还可能存在其他多靶点效应。

综上，SalB对MPTP诱导的PD模型小鼠具有神经及肠道双重保护作用；SalB能够维持肠黏膜屏障完整性、缓解GI反应，可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。