乌梅丸通过调控NLRP3炎症小体改善溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜炎症反应及细胞焦亡

李克亚 王真权 王军文

（1.湖南中医药大学第二附属医院肛肠科，长沙 410005； 2.湖南中医药大学国际教育学院，长沙 410208）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一类主要累及结肠黏膜层的炎症性肠病，以黏膜及黏膜下层弥漫性炎症为特征，持续存在的炎症反应会导致黏膜层受损并出现腹泻、黏液脓血便、腹痛等临床表现［1-2］。遗传因素、环境因素、肠道微生态因素均与UC发病有关，但具体发病机制尚不清楚，临床也缺乏有效的靶向治疗手段，常用柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪等药物有效减轻肠道炎症、缓解UC症状，但缺点是服药周期长、不良反应发生率高、易复发。

近年中医方剂在炎症性肠病治疗中的价值受到关注，乌梅丸是出自《伤寒论》的中药方，成分包括乌梅、当归、桂枝、人参、干姜、附子、花椒、细辛、黄连、黄柏等，功效为缓肝调中、清上温下［3-4］。国内一项动物实验证实乌梅丸治疗UC大鼠显著改善疾病症状、减轻炎症反应［5-6］。现代药理学研究证实乌梅丸对肝细胞、胰岛β细胞的炎症反应具有抑制作用，且抑炎作用与抑制NOD样受体热蛋白结构域3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）炎症小体活化有关［7-8］；另有UC相关研究证实NLRP3炎症小体介导的炎症反应和细胞焦亡在UC发展中起重要作用［9］。为进一步认识乌梅丸治疗UC的价值及机制，本研究设计动物实验观察和分析乌梅丸调控NLRP3炎症小体改善UC大鼠肠黏膜炎症反应及细胞焦亡的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8～10周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量180～200 g，购自上海西普尔-必凯实验动物公司，生产许可：SCXK（沪）2018-0006，实验经湖北贝恩生物科技有限公司实验动物伦理委员会批准［IACUC（申）-BNT-2022-008X］，过程遵循3R原则。

1.1.2 药品与试剂 2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）购自美国Sigma公司；乌梅丸水煎液（含生药2.88 g/ml）由湖南中医药大学第二附属医院制剂室制备，阴性对照（NC）-慢病毒（LV）、NLRP3-LV（病毒滴度2×108TU/ml）购自上海汉恒生物科技公司；IL-1β、IL-18 ELISA检测试剂盒购自上海西唐生物科技公司；GSDMD-N、NLRP3、Cleaved caspase-1、β-Tubulin特异性一抗购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、造模及给药 SD大鼠分为对照组、UC组、不同剂量乌梅丸组、NC-LV组、NC-LV+UC组、NC-LV+UC+高剂量乌梅丸组、NLRP3-LV+UC+高剂量乌梅丸组。制备UC模型：经结肠灌注含50%乙醇的TNBS溶液（150 mg/kg），次日出现腹泻、粪便中有暗红色斑点、肛门可见出血为UC造模成功，每组8只。对照组和NC-LV组结肠灌注等剂量50%乙醇，每组8只。造模次日作为给药第1天。低剂量、中剂量、高剂量乌梅丸组分别灌胃7.2、14.4、28.8 g/kg乌梅丸水提液，1次/d，连续14 d；对照组、UC组、NC-LV组、NC-LV+UC组给予等量生理盐水，1次/d，连续14 d。NC-LV组、NC-LV+UC组、NC-LV+高剂量乌梅丸组、NLRP3-LV+高剂量乌梅丸组在给药第1、7天尾静脉注射慢病毒注射液50 μl。

1.2.2 疾病活动指数（DAI）评价 给药后每天观察小鼠进食、饮水、活动等一般状况，称重并记录，观察粪便性状及便血情况，参照Harnamoto［6］标准进行DAI评分，DAI评分越高UC病情越重。

1.2.3 样本采集及处理 给药第14天下午过量麻醉处死大鼠，解剖小肠末端至直肠末端全部结肠，迅速用标尺检测结肠长度，预冷生理盐水清洗结肠、清除肠内残留粪便，取近肛门端2 cm结肠组织放入4%多聚甲醛中固定过夜，石蜡包埋，室温保存；剩余结肠组织吸尽水分，放入冻存管内液氮中冷冻保存。

1.2.4 HE染色检测结肠组织病理改变及组织学评分 取各组大鼠石蜡包埋的结肠组织，制作石蜡切片后进行HE染色，光学显微镜下观察染色情况，评价结肠组织病理改变，按照下列标准进行组织学评分：中性粒细胞及淋巴细胞浸润计0～3分，潘氏细胞和杯状细胞脱颗粒计0～2分，上皮细胞反应计0～3分，炎症病灶计0～3分，各项评分相加即为组织病理评分，评分越高结肠病理改变越重。

1.2.5 ELISA检测结肠组织炎症细胞因子 取各组大鼠液氮冷冻的结肠组织约20 mg，采用裂解液对组织进行匀浆，提取总蛋白后BCA法检测蛋白浓度，ELISA检测炎症细胞因子IL-1β、IL-18浓度，计算每毫克组织蛋白中IL-1β、IL-18含量。

1.2.6 Western blot检测结肠组织蛋白表达 取各组大鼠液氮冷冻结肠组织约20 mg，裂解液对组织进行匀浆，提取总蛋白，BCA检测蛋白浓度。将50 μg蛋白样本加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，电转至硝酸纤维素膜，置于TBST溶液配制的5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，加入2%牛血清白蛋白配制的GSDMD-N一抗（1∶1 000稀释）、NLRP3一抗（1∶400稀释）、Cleaved caspase-1一抗（1∶300稀释）、β-Tubulin一抗（1∶4 000稀释） 4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000稀释）室温孵育1 h，全自动化学发光成像系统显影得到蛋白条带，分析蛋白条带灰度值，以β-Tubulin为内参，计算GSDMD-N、NLRP3、Cleaved caspase-1表达。

1.3 统计学处理 采用SPSS22.0软件进行统计学分析，实验数据均为计量资料，以表示，采用单因素方差分析One-Way ANOVA进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量乌梅丸对UC大鼠DAI评分、结肠长度的影响 给药第1～14天，UC组大鼠DAI评分均高于对照组（P＜0.05）；给药第1天，不同剂量乌梅丸组大鼠DAI评分与UC组差异无统计学意义（P＞0.05）；给药第4天起，中、高两个剂量乌梅丸组大鼠DAI评分低于UC组（P＜0.05）；给药第7天起，低剂量乌梅丸组大鼠DAI评分低于UC组（P＜0.05）。给药第14天处死大鼠，解剖结肠并测量长度，UC组大鼠结肠长度短于对照组（P＜0.05）；低、中、高剂量乌梅丸组大鼠结肠长度均长于UC组（P＜0.05，图1）。

图1 不同剂量乌梅丸对UC大鼠DAI评分、结肠长度的影响Fig.1 Effect of different doses of Wu-Mei-Wan on DAI score and colon length of UC rats

2.2 不同剂量乌梅丸对UC大鼠结肠病理改变的影响 对照组大鼠结肠组织HE染色可见黏膜光滑、结构完整，未见组织水肿、溃疡形成及炎症细胞浸润；UC组大鼠结肠组织HE染色可见黏膜排列混乱，有溃疡或出血表现，炎症细胞大量浸润，符合UC病理特征；低、中、高剂量乌梅丸组大鼠结肠组织HE染色可见UC病理特征均明显改善（图2）。计算结肠病理组织学评分并进行组间比较，UC组大鼠组织学评分高于对照组（P＜0.05）；低、中、高剂量乌梅丸组大鼠组织学评分低于UC组（P＜0.05）。

图2 不同剂量乌梅丸对UC大鼠结肠病理改变的影响Fig.2 Effect of different doses of Wu-Mei-Wan on pathological changes of colon in UC rats

2.3 不同剂量乌梅丸对UC大鼠结肠中炎症因子含量及焦亡标志蛋白表达的影响 给药第14天处死大鼠，解剖结肠并提取结肠组织蛋白，检测炎症因子IL-1β、IL-18含量及焦亡标志蛋白GSDMD-N表达，UC组大鼠结肠组织IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N表达均高于对照组（P＜0.05）；低、中、高剂量乌梅丸组大鼠结肠组织IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N表达均低于UC组（P＜0.05，图3）。

图3 不同剂量乌梅丸对UC大鼠结肠炎症因子含量及焦亡标志蛋白表达的影响Fig.3 Effect of different doses of Wu-Mei-Wan on contents of inflammatory cytokines and expression of pyroptosis marker protein in colon of UC rats

2.4 不同剂量乌梅丸对UC大鼠结肠NLRP3炎症小体表达的影响 给药第14天处死大鼠，解剖结肠并提取结肠组织蛋白，检测NLRP3、Cleaved caspase-1表达，UC组大鼠结肠组织NLRP3、Cleaved caspase-1表达均高于对照组（P＜0.05）；低、中、高剂量乌梅丸组大鼠结肠组织NLRP3、Cleaved caspase-1表达均低于UC组（P＜0.05，图4）。

图4 不同剂量乌梅丸对UC大鼠结肠组织NLRP3炎症小体表达的影响Fig.4 Effect of different doses of Wu-Mei-Wan on NLRP3 expression inflammasome in colon of UC rats

2.5 尾静脉注射NLRP3慢病毒对高剂量乌梅丸抑制UC大鼠结肠NLRP3炎症小体表达的影响 给药第14天处死大鼠，解剖结肠并提取结肠组织蛋白，检测NLRP3、Cleaved caspase-1表达，NC-LV+UC组大鼠结肠组织NLRP3、Cleaved caspase-1表达均高于NC-LV组（P＜0.05）；NC-LV+高剂量乌梅丸组大鼠结肠组织NLRP3、Cleaved caspase-1表达均低于NC-LV+UC组（P＜0.05）；NLRP3-LV+高剂量乌梅丸组大鼠结肠组织NLRP3、Cleaved caspase-1表达均高于NC-LV+高剂量乌梅丸组（P＜0.05，图5）。

图5 尾静脉注射NLRP3慢病毒对高剂量乌梅丸抑制UC大鼠结肠NLRP3炎症小体表达的影响Fig.5 Effect of tail vein injection of NLRP3 lentivirus on high doses of Wu-Mei-Wan inhibiting NLRP3 inflammasome expression in colon of UC rats

2.6 过表达NLRP3对高剂量乌梅丸调节UC大鼠DAI评分、结肠长度的影响 给药第1～14天，NCLV+UC组大鼠DAI评分均高于NC-LV组（P＜0.05）；给药第1天，NC-LV+UC组、NC-LV+UC+高剂量乌梅丸组、NLRP3-LV+UC+高剂量乌梅丸组大鼠DAI评分与UC组差异无统计学意义（P＞0.05）；给药第4天起，NC-LV+UC+高剂量乌梅丸组大鼠DAI评分低于NC-LV+UC组（P＜0.05），NLRP3-LV+UC+高剂量乌梅丸组大鼠DAI评分高于NC-LV+UC+高剂量乌梅丸组（P＜0.05）。给药第14天处死大鼠，解剖结肠并测量长度，NC-LV+UC组大鼠结肠长度短于NC-LV组（P＜0.05）；NC-LV+UC+高剂量乌梅丸组大鼠结肠长度均长于NC-LV+UC组（P＜0.05）；NLRP3-LV+UC+高剂量乌梅丸组大鼠结肠长度均短于NC-LV+UC+高剂量乌梅丸组（P＜0.05，图6）。

图6 过表达NLRP3对高剂量乌梅丸调节UC大鼠DAI评分、结肠长度的影响Fig.6 Effect of NLRP3 overexpression on high dose of Wu-Mei-Wan regulating DAI score and colon length of UC rats

2.7 过表达NLRP3对高剂量乌梅丸改善UC大鼠结肠病理改变的影响 HE染色可见NC-LV组大鼠结肠组织黏膜光滑、结构完整，未见组织水肿、溃疡形成及炎症细胞浸润；NC-LV+UC组大鼠结肠组织黏膜排列混乱、有溃疡或出血表现、炎症细胞大量浸润，符合UC病理特征；NC-LV+UC+高剂量乌梅丸组大鼠结肠组织病理特征明显改善；NLRP3-LV+UC+高剂量乌梅丸组大鼠结肠组织病理特征明显加重。计算结肠病理组织学评分，NC-LV+UC组大鼠组织学评分高于NC-LV组（P＜0.05）；NC-LV+UC+高剂量乌梅丸组大鼠组织学评分低于NC-LV+UC组（P＜0.05）；NLRP3-LV+UC+高剂量乌梅丸组大鼠组织学评分高于NC-LV+UC+高剂量乌梅丸组（P＜0.05，图7）。

图7 过表达NLRP3对高剂量乌梅丸改善UC大鼠结肠病理改变的影响Fig.7 Effect of of NLRP3 overexpression on high doses of Wu-Mei-Wan improving pathological changes of UC rats

2.8 过表达NLRP3对高剂量乌梅丸抑制UC大鼠结肠炎症因子含量及焦亡标志蛋白表达的影响给药第14天处死大鼠，解剖结肠并提取结肠组织蛋白，检测炎症因子IL-1β、IL-18含量及焦亡标志蛋白GSDMD-N表达，NC-LV+UC组大鼠结肠组织IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N表达均高于NC-LV组（P＜0.05）；NC-LV+UC+高剂量乌梅丸组大鼠结肠组织IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N表达均低于NC-LV+UC组（P＜0.05）；NLRP3-LV+UC+高剂量乌梅丸组大鼠结肠组织IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N表达高于NC-LV+UC+高剂量乌梅丸组（P＜0.05，图8）。

图8 过表达NLRP3对高剂量乌梅丸抑制UC大鼠结肠中炎症因子含量及焦亡标志蛋白表达的影响Fig.8 Effect of NLRP3 overexpression on high dose of Wu-Mei-Wan inhibiting inflammatory cytokines contents and pyroptosis marker protein expression in colon of UC rats

3 讨论

UC是主要累及结肠和直肠的非特异性炎症性肠病，病变局限于黏膜及黏膜下层，局部组织主要病理改变包括炎症反应激活及细胞凋亡、坏死、焦亡异常等［10-11］。目前临床治疗UC的常规药物为柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪，但受限于服药周期长、不良反应发生率高、易复发等缺点，上述药物治疗UC的疗效不尽如人意。

中医治疗有“急则治其标、缓则治其本”的临床优势，已成为近年治疗UC的新思路，契合诱导缓解、维持缓解和预防并发症的UC治疗目标［12-14］。中医认为UC属于“泄泻”“久痢”“肠癖”范畴，其发病与“湿热”“热毒”“痰浊”有关［15］。乌梅丸出自《伤寒论》，方中乌梅为君药，具有涩肠止痢功效；花椒、细辛、黄连、黄柏共为臣药，具有袪寒清热功效；附子、干姜、桂枝、人参、当归共为佐药，具有养气血、袪寒湿功效［16-17］。网络药理学研究及临床研究已证实乌梅丸治疗UC的积极价值，推测乌梅丸能够针对UC的中医病机进行袪寒清热、涩肠止痢［18-19］。但乌梅丸治疗UC的深层机制仍需进一步探索。

马清林等［5］使用乌梅丸治疗TNBS诱导的UC大鼠，结果显示乌梅丸能够以剂量依赖的方式减轻UC病情和病理改变，抑制肠黏膜内炎症细胞因子生成。本研究采用相同方式建立UC模型，TNBS诱导后UC大鼠DAI水平升高且肠黏膜出现典型UC病理改变，不同剂量乌梅丸治疗后DAI水平降低、肠黏膜病理改变减轻，与马清林等［5］结果一致。表明UC造模成功且乌梅丸具有治疗UC的作用，在此基础上本研究将分析乌梅丸治疗UC的分子生物学机制。

NLRP3炎症小体参与炎症反应及细胞焦亡调控，能够通过细胞内结构域招募caspase-1并使其裂解为有活性的Cleaved caspase-1，后者一方面作用于IL-1β及IL-18前体，生成有活性的IL-1β及IL-18成熟体并介导炎症反应，另一方面作用于GSDMD氨基末端生成GSDMD-N并介导细胞焦亡。临床研究证实UC肠黏膜中NLRP3炎症小体表达增加［20］；动物实验证实抑制NLRP3炎症小体显著改善UC病理改变并减轻炎症反应、细胞焦亡［21］。提示肠黏膜中NLPR3炎症小体介导的炎症反应和细胞焦亡参与UC发生发展，一方面通过IL-1β及IL-18的生物学作用引起或加重肠黏膜炎症反应，另一方面通过GSDMD-N的生物学作用引起或加重肠黏膜焦亡，两方面共同作用加重肠黏膜损伤，促进UC病情进展。本研究同样在UC大鼠结肠组织中检测到IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N、NLRP3、Cleaved caspase-1表达显著增加，与既往NLRP3炎症小体激活参与UC发生发展的结果吻合。

现代药理学研究证实乌梅丸具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗焦亡等活性，多项研究结果显示乌梅丸对NLRP3炎症小体激活及其下游炎症反应、细胞焦亡均具有抑制作用。本研究观察了乌梅丸治疗UC过程中对NLRP3炎症小体的调控作用，不同剂量乌梅丸治疗UC大鼠后结肠组织IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N、NLRP3、Cleaved caspase-1表达显著降低，表明乌梅丸用于UC治疗显著抑制NLRP3炎症小体激活。进一步观察乌梅丸是否通过抑制NLRP3炎症小体治疗UC，乌梅丸灌胃同时尾静脉注射NLRP3-LV实现NLRP3过表达，过表达NLRP3后，乌梅丸降低UC大鼠DAI水平、改善肠黏膜病理改变、抑制IL-1β、IL-18生成及GSDMD-N表达的作用均被削弱，提示乌梅丸治疗UC的价值与其抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应和细胞焦亡有关。

综上，本研究动物实验证实了乌梅丸治疗UC的价值，同时初步揭示了乌梅丸发挥治疗价值的分子机制，乌梅丸抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应及细胞焦亡是其治疗UC的分子机制之一。