基于IL-17/NF-κB信号通路探讨敦煌医方大补脾汤联合奥沙利铂对胃癌荷瘤小鼠炎症免疫的影响

曾元丁 苏韫 龚红霞 牛世伟 张晗

（甘肃中医药大学基础医学院，甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室，兰州 730000）

近年随着对炎症与肿瘤关系研究的深入，研究重点转变为慢性胃炎的“炎-癌转化”模式［1-2］。研究表明胃癌患者肿瘤组织及血清中IL-17含量增加，NF-κB相关通路蛋白表达上升，表明胃癌组织中IL-17含量升高可使NF-κB水平上升，NF-κB信号通路下游IL-6表达增加，导致炎症加重以及胃癌发生与发展［3］。

大补脾汤是敦煌医理类著作《辅行诀脏腑用药法药》中的方剂之一，具有补虚扶正、化生气血之功效，符合胃癌病因病机之一，本研究采用胃癌细胞MFC建立胃癌荷瘤小鼠模型，从免疫调节角度探讨敦煌医方大补脾汤对胃癌荷瘤小鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及动物 小鼠胃癌细胞株MFC，批号：PNS-MC-20，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。60只SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，购自甘肃中医药大学动物实验管理中心，合格证号：SCXK（甘）2020-0001。本研究根据甘肃中医药大学伦理委员会指导进行（2020-283）。

1.1.2 药物 大补脾汤由人参15 g、黄芪15 g、当归3 g、麦冬5 g、白术10 g、干姜15 g、炙甘草15 g、旋覆花5 g、五味子5 g组成，购自甘肃中医药大学附属医院，经甘肃中医药大学中药学教研室杨秀娟副教授鉴定。奥沙利铂购自山东罗欣药业有限公司，批号：519121041。

1.1.3 试剂 RPMI1640培养液（美国Gibco公司，批号：11835-030）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：11012-8611）；4%多聚甲醛、HE试剂、柠檬酸（pH=6.0）抗原修复液、组化试剂盒DAB显色液（Servicebio公司，批号：P1101、G1004、G1202、G1211）；Trizol总RNA提取试剂盒、第一链互补DNA（cDNA）Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR mix（德国Qiagen公司，批号：74256、205824、3306-11）；IL-6、IL-17 ELISA试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司，批号：MM-0163-M1、MM-017M2）；IL-6、IL-17、NF-κB p65、pNF-κB p65抗体（Gene Tex公司，批号：GTX110527；Servicebio公司，批号：GB11110；Immunoway公司，批号：YT3107；Gene Tex公司，批号：GTX133899）。

1.1.4 仪器 无菌超净工作台（苏州净化设备有限公司）；CO2恒温培养箱（日本SANYO）；倒置相差显微镜、光学显微镜（日本Olympus）；IMark酶标分析仪、垂直电泳槽、电泳仪、凝胶成像仪（美国Bio-Rad）；电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；脱水机（日本DIAPATH）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及胃癌荷瘤小鼠模型构建 胃癌细胞MFC用含10%胎牛血清、1%双抗溶液的RPMI1640培养液于37 ℃、5%CO2下培养，培养至对数生长期调整密度为1×107个/ml，将0.2 ml细胞悬液接种于每只小鼠右腋下，接种5～7 d可触及结节且直径长至5 mm时造模成功。

1.2.2 动物分组及给药 将造模成功的胃癌荷瘤小鼠按随机数表法分为模型组、奥沙利铂组、大补脾汤高、中、低剂量加奥沙利铂组（简称联合用药高、中、低剂量组），每组10只，雌雄分笼饲养。根据小鼠和人体表面积比值0.002 6计算小鼠给药剂量，奥沙利铂为10 mg/kg，大补脾汤高、中、低剂量分别为21.58、10.79、5.40 g/kg，给药量为0.2 ml，周期14 d。另随机选取10只昆明小鼠作为空白组，空白组和模型组灌胃给予等体积生理盐水。

1.2.3 测定抑瘤率 最后1次给药后24 h从小鼠眼球取血，离心分离血清冷冻备用。颈椎脱臼法处死小鼠，完全剥离皮下移植瘤，称重并记录。抑瘤率（%）=（模型组总平均瘤重-药物组总平均瘤重）/模型组总平均瘤重×100%。

1.2.4 ELISA检测血清IL-17、IL-6含量 各组小鼠取血，分离血清，-80 ℃保存，按ELISA试剂盒说明检测血清IL-17、IL-6水平。

1.2.5 RT-qPCR检测各组小鼠肿瘤组织IL-17和NF-κB p65mRNA表达 Trizol法从合适的肿瘤组织中提取总RNA，逆转录为cDNA，按照荧光实时定量PCR试剂盒制备反应体系测定基因表达，反应要求为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环，绘制熔解曲线，基于各组Ct值，通过内参数值和目的基因数值计算ΔCt和ΔΔCt，最终得出2-ΔΔCt，即各组IL-17、NF-κB p65mRNA相对表达。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of PCR

1.2.6 免疫组化检测各组小鼠肿瘤组织IL-17、IL-6和NF-κB p65蛋白表达 肿瘤组织石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中脱蜡15 min，梯度乙醇脱水，蒸馏水漂洗，置于柠檬酸抗原修复缓冲液高压抗原修复，PBS冲洗3次；3%过氧化氢溶液中室温避光孵育25 min，PBS冲洗3次，室温密封30 min；加入IL-17、IL-6和NF-κB p65抗体稀释液（1∶800），湿盒内4 ℃孵育过夜，加入二抗稀释液（1∶200）室温摇床孵育50 min，DAB显色，复染细胞核，脱水封片，显微镜下观察颜色变化，图像分析系统20倍物镜下，每张切片随机选取5个视野，测定肿瘤组织内IL-17、IL-6和NF-κB p65表达颗粒积分光密度，取平均值作为该只小鼠肿瘤组织IL-17、IL-6和NF-κB p65蛋白表达。

1.2.7 Western blot检测各组小鼠肿瘤组织IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白表达 从适当大小肿瘤组织中提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，煮沸变性5 min，-20 ℃储存，SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入TIL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65一抗稀释液（1∶1 000稀释） 4 ℃冷藏过夜，TBST洗3次，加入二抗稀释液（1∶5 000）室温孵育2 h，ECL曝光，Image J软件分析各蛋白条带灰度值，与内参进行比较，分析蛋白相对表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件分析数据，计量资料以表示，组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大补脾汤对胃癌荷瘤小鼠抑瘤作用的影响与模型组相比，各给药组小鼠瘤重显著减轻（P＜0.01）；与奥沙利铂组相比，联合用药高、中剂量组差异显著（P＜0.01）。奥沙利铂组和联合用药高、中、低剂量组抑瘤率分别为33.02%、52.92%、46.33%、39.52%（表2）。

表2 大补脾汤对各组胃癌荷瘤小鼠瘤体质量及抑瘤率的影响（，n=10）Tab.2 Effect of Dabupi Decoction on tumor weight and tumor inhibition rate of gastric cancer-bearing mice in each group （，n=10）

表2 大补脾汤对各组胃癌荷瘤小鼠瘤体质量及抑瘤率的影响（，n=10）Tab.2 Effect of Dabupi Decoction on tumor weight and tumor inhibition rate of gastric cancer-bearing mice in each group （，n=10）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01； compared with oxaliplatin group， 2）P＜0.01.

Tumor inhibition rate/%-33.02 52.92 46.33 39.52 Groups Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose Tumor weight/g 1.28±0.09 0.86±0.061）0.60±0.031）2）0.69±0.051）2）0.78±0.051）

2.2 大补脾汤对胃癌荷瘤小鼠血清IL-17和IL-6含量的影响 与空白组相比，模型组血清IL-17和IL-6含量显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，各给药组血清IL-17和IL-6含量显著降低（P＜0.01）；与奥沙利铂组相比，联合用药高、中、低剂量组血清IL-17含量显著降低（P＜0.01，P＜0.05），联合用药高、中剂量组血清IL-6表达下降（P＜0.01，P＜0.05），联合用药低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05，表3）。

表3 大补脾汤对各组胃癌荷瘤小鼠血清IL-17和IL-6含量的影响（，n=10，pg/ml）Tab.3 Effect of Dabupi Decoction on serum concentrations of IL-17 and IL-6 of gastric cancer-bearing mice in each group （，n=10，pg/ml）

表3 大补脾汤对各组胃癌荷瘤小鼠血清IL-17和IL-6含量的影响（，n=10，pg/ml）Tab.3 Effect of Dabupi Decoction on serum concentrations of IL-17 and IL-6 of gastric cancer-bearing mice in each group （，n=10，pg/ml）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.01；compared with model group， 2）P＜0.01；compared with oxaliplatin group， 3）P＜0.05，4）P＜0.01.

IL-6 64.14±4.47 114.41±8.221）92.99±6.762）73.37±6.602）4）82.19±3.832）3）84.43±6.292）Groups Control Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose IL-17 50.62±2.95 99.59±6.841）79.32±5.032）56.17±5.862）4）63.60±3.982）4）70.49±4.632）3）

2.3 大补脾汤对胃癌荷瘤小鼠肿瘤组织IL-17和NF-κB p65mRNA表达的影响 与模型组相比，各给药组IL-17和NF-κB p65mRNA表达显著下降（P＜0.01）；与奥沙利铂组相比，联合用药高、中剂量组IL-17和NF-κB p65mRNA表达显著下降（P＜0.05，P＜0.01），联合用药低剂量组IL-17和NF-κB p65mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05，表4）。

表4 大补脾汤对胃癌荷瘤小鼠肿瘤组织IL-17和NF-κB p65 mRNA表达的影响（，n=10）Tab.4 Effect of Dabupi Decoction on IL-17 and NF-κB p65 mRNA expressions in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice （，n=10）

表4 大补脾汤对胃癌荷瘤小鼠肿瘤组织IL-17和NF-κB p65 mRNA表达的影响（，n=10）Tab.4 Effect of Dabupi Decoction on IL-17 and NF-κB p65 mRNA expressions in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice （，n=10）

Note：Compared with model group，1）P＜0.01； compared with oxaliplatin group， 2）P＜0.05， 3）P＜0.01.

NF-κB p65 1.00±0.00 0.84±0.021）0.63±0.051）3）0.75±0.011）2）0.78±0.031）Groups Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose IL-17 1.00±0.00 0.60±0.051）0.40±0.031）3）0.51±0.021）3）0.56±0.011）

2.4 免疫组化法检测胃癌荷瘤小鼠肿瘤组织中IL-17、IL-6和NF-κB p65定位和蛋白定量 蛋白阳性表达显示为细胞核或细胞质出现棕黄色或棕色颗粒。与模型组相比，各给药组IL-6、IL-17和NF-κB p65蛋白表达显著下降（P＜0.01，P＜0.05）；与奥沙利铂组相比，联合用药高剂量组IL-6、IL-17和NF-κB p65蛋白表达显著降低（P＜0.01，P＜0.05），联合用药中剂量组NF-κB p65蛋白表达显著下降（P＜0.01，图1、表5）。

图1 IHC检测各组IL-17、IL-6和NF-κB表达（×200）Fig.1 IL-17， IL-6 and NF-κB expressions in each group detected by IHC （×200）

表5 大补脾汤对各组胃癌荷瘤小鼠肿瘤组织IL-17、IL-6和NF-κB p65蛋白表达的影响（，n=10）Tab.5 Effect of Dabupi Decoction on IL-17， IL-6 and NF-κB p65 protein expressions in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice in each group （，n=10）

表5 大补脾汤对各组胃癌荷瘤小鼠肿瘤组织IL-17、IL-6和NF-κB p65蛋白表达的影响（，n=10）Tab.5 Effect of Dabupi Decoction on IL-17， IL-6 and NF-κB p65 protein expressions in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice in each group （，n=10）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with oxaliplatin group， 3）P＜0.05， 4）P＜0.01.

Groups Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose IL-17 0.46±0.09 0.36±0.021）0.27±0.062）3）IL-6 0.42±0.07 0.35±0.082）0.24±0.042）3）NF-κB p65 0.55±0.04 0.42±0.052）0.28±0.032）4）0.30±0.022）0.29±0.042）0.35±0.022）3）0.32±0.032）0.30±0.022）0.39±0.032）

2.5 大补脾汤对胃癌荷瘤小鼠肿瘤组织中IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白表达的影响 与模型组相比，各给药组IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白表达显著下降（P＜0.01）；与奥沙利铂组相比，联合用药高剂量组IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.01），联合用药中、低剂量组IL-6和pNF-κB p65蛋白表达下降（P＜0.05，P＜0.01），NF-κB p65蛋白表达差异无统计学意义（图2、表6）。

图2 Western blot检测各组胃癌荷瘤小鼠肿瘤组织IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白表达Fig.2 IL-6， NF-κB p65 and pNF-κB p65 protein expressions in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice in each group detected by Western blot

表6 大补脾汤对胃癌荷瘤小鼠肿瘤组织IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白含量的影响（，n=10）Tab.6 Effect of Dabupi Decoction on IL-6， NF-κB p65 and pNF-κB p65 protein contents in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice （，n=10）

表6 大补脾汤对胃癌荷瘤小鼠肿瘤组织IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白含量的影响（，n=10）Tab.6 Effect of Dabupi Decoction on IL-6， NF-κB p65 and pNF-κB p65 protein contents in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice （，n=10）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01； compared with oxaliplatin group， 2）P＜0.05， 3）P＜0.01.

Groups Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose IL-6/GAPDH 1.32±0.01 1.05±0.041）0.76±0.041）3）NF-κB p65/GAPDH 1.29±0.01 1.02±0.011）0.75±0.021）3）pNF-κB p65/GAPDH 1.42±0.05 0.91±0.051）0.61±0.041）3）0.90±0.071）3）0.93±0.071）0.67±0.021）3）0.93±0.071）2）0.96±0.061）0.80±0.051）2）

3 讨论

在祖国医学中，胃癌归属于“噎膈”“胃脘痛”等范畴，近代医家总结胃癌病因病机，病因可分为风寒湿等六淫邪毒外因和饮食不节、正气内虚等内因，相互作用可导致脾胃脏腑功能失调，使气滞、血瘀、痰结、热毒等久稽于胃，导致癌肿［4］；病机主要包括瘀血内阻、癌毒蕴胃、气滞痰凝、气血不足等［5-8］。针对其气血不足的病机，本研究选用敦煌医方大补脾汤发挥补虚扶正、化生气血功效。李应存教授临床运用大补脾汤治疗慢性萎缩性胃炎疗效显著［9］。大补脾汤是敦煌医理类著作《辅行诀脏腑用药法药》中的方剂之一，原方“大补脾汤。治脾气大疲，饮食不化，呕吐下利，其人枯瘦如柴，立不可动转，口中苦干渴，汗出，气急，脉微而时结者方。人参、甘草炙，各三两，干姜三两，白术、麦门冬、五味子旋覆花一方作牡丹皮，当从。各一两。右七位，以水一升，煮取四升，温分四服，日三，夜一服”［10］。从全方看人参大补元气，健脾化湿兼滋阴固肾，使正气复而邪气自除，方中重用人参、炙甘草为君药，大补元气，健脾复脉；干姜可入脾胃经，温中散寒；白术、麦冬益胃生津；五味子可入肾经，益气生津，滋肾固精；旋覆花可入肝、胃经，消痞止呕，善降胃气。

炎症作为肿瘤十大生物学特点之一，在肿瘤发生中起重要作用。炎症能够促进癌症发生和进展，炎症介质可释放一系列炎症细胞因子，从而诱发连续炎症反应，促进肿瘤细胞生长、转移等，抑制免疫系统［11］。IL-17/NF-κB信号通路作为一条重要的炎症信号通路，对机体炎症反应、细胞凋亡等病理过程起重要作用，可参与胃癌的发生发展。IL-17是高度通用的促炎细胞因子，对炎症性疾病发病机制和癌症进展等至关重要。IL-17/IL-17R主要通过活化NF-κB信号转导通路发挥作用，机体受到炎症刺激时，IL-17与细胞表面的IL-17受体特异性结合，通过一系列翻译修饰后的NF-κB活化并入核，发挥相应生物学效应［12］。NF-κB作为一种转录因子复合物，被上游激活后调节下游炎症反应信号通路相关基因IL-6、IL-10及TNF-α等表达［13］。IL-6作为下游与IL-6受体结合后，通过激活下游信号转导途径，从而促进肿瘤发生发展［14］。牟晓映等［15］发现胃癌患者血液中Th17、IL-17和IL-6高表达，患者机体免疫功能紊乱，可能促进胃癌发生发展。

本研究通过称取肿瘤重量计算抑瘤率研究大补脾汤联合奥沙利铂对胃癌荷瘤小鼠的抑瘤作用，发现与模型组相比，各给药组抑瘤率升高而肿瘤重量降低，大补脾汤高、中剂量联合奥沙利铂组效果均显著优于奥沙利铂组。大补脾汤在抑制肿瘤生长方面发挥其大补元气、增效减毒功效，且全方标本兼顾，抑瘤作用显著。本研究基于IL-17/NF-κB通路探讨大补脾汤对胃癌荷瘤小鼠炎症免疫的作用机制，ELISA、免疫组化、Western blot、RT-qPCR分别检测血清IL-17和IL-6及肿瘤组织IL-17、IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65 mRNA和蛋白表达，结果表明大补脾汤联合用药组IL-17、IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65 mRNA及蛋白较模型组均显著下降，提示大补脾汤可能通过抑制IL-17/NF-κB信号通路关键分子mRNA和蛋白表达调控炎症免疫，抑制胃癌发生发展。

综上，敦煌医方大补脾汤对MFC胃癌荷瘤小鼠具有一定抑瘤作用，可能通过抑制IL-17/NF-κB信号通路调控炎症免疫，抑制胃癌发生发展。