miR-146a调控TLR4/NF-κB通路对脑出血模型大鼠的保护作用及机制研究

吴俊波 杨杰 肖锋 李金亮

（1.萍乡市第二人民医院，萍乡 337000； 2.萍乡市第三人民医院，萍乡 337099）

脑出血多见于中老年人，其病因复杂，可由高血压、情绪起伏大等因素引起［1-2］。脑出血病情发展迅速，血管破裂后，出血灶血液压迫周围脑组织，并发脑水肿、脑移位、脑疝等，治疗不及时会造成半身不遂、身体麻痹、痴呆等后遗症［3-5］。目前脑出血后炎症损伤是临床研究热点。脑出血发生后，病灶附近小胶质细胞被激活，引发炎症反应，TLR4作为模式识别受体在小胶质细胞中表达，参与机体免疫及炎症反应，TLR4被激活后促进炎症因子过表达［6］。NF-κB位于TLR4下游，被激活后加重炎症反应，不利于改善脑出血后继发性损伤［7］。研究表明，大鼠脑缺血再灌注后伴有脑组织TLR4、NF-κB阳性表达增加［8］。目前研究指出，miRNAs可减轻脑缺血动物模型炎症反应，减少神经元细胞凋亡［9］。研究还指出，miR-146a通过调控其相关靶基因发挥抗炎作用，通过抑制靶基因水平缓解炎症反应［10］。本研究旨在探索miR-146a对脑出血模型大鼠神经功能及炎症因子的影响并研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级成年SD雄性大鼠，12周龄，体质量220～250 g，于鼠笼中饲料喂养，饮水自由，光照充足，室温20～25 ℃，相对湿度45%～55%（伦理批号：ACU20-396）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及脑出血模型大鼠构建 选取40只大鼠，随机分为假手术组、模型组、过表达miR-146a腺病毒注射组（腺病毒组）及阴性病毒注射组（阴性病毒组），每组10只。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，右侧股动脉采血，将大鼠俯卧位固定，切开皮肤，暴露前囟，微量注射器于前囟前0.2 mm、右侧中线旁开3.0 mm、冠状缝前0.2 mm钻孔，孔直径3.0 mm；翻转分离尾动脉，微量进样器穿刺抽血50 μl，50 μl自体血于5 min内匀速注射，留针15 min缓慢退出，无菌骨腊封闭颅骨小孔。假手术组步骤相同，注射等量生理盐水。过表达miR-146a腺病毒注射组取3×1013U/ml病毒滴度腺病毒50 μl，与自体血一次性注射至基底节部位。

1.2.2 大鼠神经功能评分 Garcia评分包括体态对称性、自主运动状况、前肢伸展运动能力、网屏实验、本体感觉、两侧的触须反应、两侧身体的触觉反应等［11］，总分3～18分，分数越低，神经功能越差。

1.2.3 大鼠血肿周围病理组织改变 0.35 ml/100 g 1%水合氯醛麻醉后处死大鼠，解剖大鼠血肿周围（2.0～3.0 mm）脑组织于4%多聚甲醛固定48 h，脱钙，石蜡包埋，制成切片，厚度5 μm，脱蜡，梯度乙醇水洗后复染，冲洗，0.5%盐酸乙醇分化3 s，冲洗，复染，95%乙醇脱水2 min，重复，二甲苯透明5 min，重复，中性树胶封片。

1.2.4 大鼠炎症因子表达 取大鼠脑组织，添加RIPA裂解液（1 ml/100 mg）匀浆，1 000 r/min离心20 min，留上清，ELISA检测IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达，操作步骤严格按照说明书进行。

1.2.5 大鼠脑组织TLR4、NF-κB蛋白表达 取留存大鼠脑组织，添加RIPA裂解液（1 ml/100 mg）匀浆，收集脑组织总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，取30 μl处理后的蛋白样品，SDS-PAGE电泳，PVDF转膜，以GAPDH为内参。配制5%脱脂奶粉封闭液，添加TLR4、NF-κB一抗4 ℃孵育过夜，室温孵育二抗2 h，ECL显色，计算和分析蛋白相对灰度值。

1.2.6 大鼠脑组织TLR4、NF-κB mRNA表达 取5.0 mm3大鼠脑组织研磨，添加Trizol（50 mg/ml）裂解细胞，提取总RNA，加入Trizol与样品（3∶1），混匀，静置5 min，加入200 μl氯仿，静置，离心，取上层RNA，加入异丙醇，静置，离心，留沉淀，加入75%无水乙醇离心，弃上清，室温干燥RNA 10 min，加DEPC水溶解RNA，测定RNA浓度及纯度。取1 μg总RNA反转录合成cDNA，得到cDNA进行实时荧光定量PCR，以GAPDH为内参，2-ΔΔCt计算目的基因表达。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件分析数据，计量资料以记录，组间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 与假手术组相比，模型组、腺病毒组、阴性病毒组大鼠神经功能评分降低（P＜0.05）；与模型组相比，腺病毒组大鼠神经功能评分升高（P＜0.05），阴性病毒组差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 神经功能评分（，n=10）Tab.2 Neurological function scores （，n=10）

表2 神经功能评分（，n=10）Tab.2 Neurological function scores （，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group.

Neurological function score/score 16.10±1.20 6.80±0.631）12.50±1.582）6.60±0.70 177.677 0.000 Groups Control Model Adenovirus Negative virus F P

2.2 各组大鼠血肿周围病理组织改变 假手术组大鼠脑组织细胞形态结构完整，排列整齐，无水肿及炎症细胞浸润；模型组大鼠脑组织细胞形态异常，间隙增大，部分神经细胞坏死，出现水肿及炎症细胞浸润；腺病毒组大鼠脑组织水肿范围变小、程度减轻，炎症细胞浸润减轻，细胞周围间隙变小；阴性病毒组肿胀程度仍较明显，可见明显炎症浸润（图1）。

图1 血肿周围病理组织改变Fig.1 Pathological changes around hematoma

2.3 各组大鼠炎症因子表达 与假手术组相比，模型组大鼠炎症因子水平均升高（P＜0.05）；与模型组相比，腺病毒组大鼠炎症因子水平均下降（P＜0.05，表3）。

表3 各组大鼠IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达（，n=10，pg/ml）Tab.3 Expressions of IL-1β， IL-6， IL-8 and TNF-α of rats in each group （，n=10，pg/ml）

表3 各组大鼠IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达（，n=10，pg/ml）Tab.3 Expressions of IL-1β， IL-6， IL-8 and TNF-α of rats in each group （，n=10，pg/ml）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group.

TNF-α 4.58±0.20 9.26±0.981）5.47±0.282）8.81±0.87 120.943 0.000 Groups Control Model Adenovirus Negative virus F P IL-1β 3.82±0.25 14.69±1.551）4.91±0.332）13.88±1.41 289.817 0.000 IL-6 2.96±0.23 9.44±1.401）3.55±0.382）8.96±1.22 129.884 0.000 IL-8 1.06±0.05 2.63±0.151）1.33±0.062）2.43±0.10 632.311 0.000

2.4 各组大鼠脑组织TLR4、NF-κB蛋白表达 与假手术组相比，模型组大鼠TLR4、NF-κB蛋白表达均增加（P＜0.05）；与模型组相比，腺病毒组大鼠TLR4、NF-κB蛋白表达均下降（P＜0.05），阴性病毒组差异无统计学意义（P＞0.05，图2、表4）。

图2 各组大鼠脑组织TLR4、NF-κB蛋白表达Fig.2 Expressions of TLR4 and NF-κB proteins in brain tissues of rats in each group

表4 各组大鼠脑组织TLR4、NF-κB蛋白表达（，n=10）Tab.4 Expressions of TLR4 and NF-κB proteins of rat brain tissues in each group （，n=10）

表4 各组大鼠脑组织TLR4、NF-κB蛋白表达（，n=10）Tab.4 Expressions of TLR4 and NF-κB proteins of rat brain tissues in each group （，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group.

NF-κB 0.48±0.17 1.03±0.341）0.53±0.202）0.99±0.30 12.611 0.000 Groups Control Model Adenovirus Negative virus F P TLR4 0.21±0.09 0.69±0.181）0.23±0.102）0.58±0.15 33.593 0.000

2.5 大鼠脑组织TLR4、NF-κB mRNA表达 与假手术组相比，模型组大鼠TLR4、NF-κB mRNA表达均增加（P＜0.05）；与模型组相比，腺病毒组大鼠TLR4、NF-κB mRNA表达均下降（P＜0.05），阴性病毒组差异无统计学意义（P＞0.05，表5）。

表5 大鼠脑组织TLR4、NF-κB mRNA表达（，n=10）Tab.5 mRNA expressions of TLR4 and NF-κB in rat brain tissues （，n=10）

表5 大鼠脑组织TLR4、NF-κB mRNA表达（，n=10）Tab.5 mRNA expressions of TLR4 and NF-κB in rat brain tissues （，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group.

NF-κB 1.06±0.11 1.88±0.361）1.08±0.142）1.85±0.30 33.508 0.000 Groups Control Model Adenovirus Negative virus F P TLR4 1.15±0.10 2.24±0.481）1.23±0.142）2.01±0.45 26.246 0.000

3 讨论

脑出血患者颅内血肿部分易压迫周围完好脑组织，给脑细胞带来严重损害，患者可能出现半身不遂、身体麻痹、痴呆等后遗症，具有较高的致残率和病死率，给患者及其家庭带来较大负担［12］。研究指出，脑出血患者红细胞裂解、炎症反应增加，一定程度增加脑水肿发生风险，给患者造成更严重损害，从而引起患者预后不良［13］。脑出血患者血肿部分炎症反应是预后的重要影响因素，也是现阶段临床研究热点。脑出血炎症反应与信号通路、基因表达、炎症因子水平等相关，作用机制复杂。研究表明，NF-κB信号通路参与脑出血患者脑组织炎症反应发生发展，NF-κB可与相对应靶基因相结合，调控其表达，在对应mRNA作用下，调控Th1、Th2相关炎症因子水平，影响炎症反应进程［14］。miRNAs也与脑出血发生发展密切相关，其中，过表达miR-146a可降低脑出血后炎症介质水平，如IL-6、IL-8等，减轻脑出血后炎症反应，减少细胞死亡，保护神经［15］。本研究旨在探索miR-146a对脑出血模型大鼠神经功能及炎症因子的影响并研究其作用机制。

miR-146a在机体病毒入侵、免疫紊乱、炎症反应中具有重要作用。miR-146a调控对应靶基因影响相关因子表达，活化IRAK1及TNF受体相关因子TRAF6，使NF-κB移位入核，促进炎症因子激活，呈过表达［16］。近年越来越多的研究发现miR-146a在炎症反应、免疫应答、神经系统、癌症、脑出血等中异常表达，成为临床研究重点［17］。TLR4/NF-κB通路参与脑出血后炎症损伤进程，其中NF-κB是通路关键靶点，脑出血患者出现NF-κB活化，促进炎症因子过表达，加重炎症反应，另外，炎症因子又能激活NF-κB，使炎症严重程度进一步加重，损害脑组织［18］。TLR4也与机体炎症反应密切相关，与对应配体结合将信号转导至Toll样受体/白介素-1受体同源域，激活NF-κB，促进炎症因子过表达，放大炎症效应，长此以往，恶性循环，加重脑出血引发的继发性炎症损伤［19］。由此猜测抑制TLR4/NF-κB信号通路活化可能减轻脑出血患者炎症反应，改善预后，延长生存时间。

通过Garcia评分研究miR-146a对脑出血模型大鼠神经功能的影响，发现脑出血大鼠神经功能严重受损，而过表达miR-146a腺病毒组大鼠Garcia评分较模型组出现明显回升，证实miR-146a过表达干预可改善脑出血后大鼠神经功能损伤。本研究还发现，模型组大鼠细胞形态异常，间隙增加，出现水肿及炎症细胞浸润，过表达miR-146a腺病毒注射组大鼠脑组织水肿、炎症细胞浸润减轻，细胞间隙变小，证实miR-146a可改善脑出血模型大鼠炎症反应。张浩等［20］研究指出，TLR4基因敲除小鼠体内炎症因子水平显著下降，组织损伤也相对减轻。本研究还发现，脑出血模型大鼠均存在不同程度TLR4、NF-κB蛋白、基因及炎症因子表达增加，过表达miR-146a腺病毒干预后，大鼠TLR4、NF-κB蛋白、基因及炎症因子水平均有所回落，提示miR-146a对TLR4/NF-κB通路及相关炎症因子具有调控作用。

综上，miR-146a可减轻脑出血模型大鼠神经功能及炎症损伤，可能通过抑制脑出血模型大鼠脑组织TLR4/NF-κB信号通路激活，降低炎症因子水平，但鉴于miR-146a靶点较多，本研究仅从蛋白、基因水平证实miR-146a抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻神经功能损伤及炎症反应，还需深入研究。