4天香烟烟雾暴露联合poly（I：C）刺激对小鼠肺部免疫应答及干扰素表达的影响

董晓飞 梁紫尧 范龙 全景羽 林琳 周颖芳 吴蕾 于旭华

（1.广州医科大学，广州 510150； 2.广州中医药大学第二附属医院，广州 510120； 3.粤港澳中医药与免疫疾病研究联合实验室，广州 510290）

吸烟对人体免疫系统具有复杂的影响［1］。研究表明，与不吸烟人群相比，吸烟者感染流感病毒风险增加［2］。但吸烟对呼吸道抗病毒免疫的影响并不清楚。TLR3是病毒入侵宿主后激活宿主免疫的主要途径，也是促进Ⅰ型干扰素生成的主要途径。本研究通过观察香烟烟雾对TLR3激动剂聚肌苷聚胞苷酸钠poly（I：C）诱导的气道免疫炎症反应和Ⅰ型干扰素及干扰素刺激基因的影响，明确香烟烟雾暴露对TLR3激活诱导的免疫应答的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 poly（I：C）、盐酸吖啶橙溶液、溴化乙锭（Sigma，货号：019M4060v、8097-10ML、E1510-10-ML）；SteadyPure通用RNA提取试剂盒、SYBR Green Pro Tab HS预混型qPCR试剂盒（Accurate Biology，货号：AG21017、AG11701）；KWIK-DIFF溶液#1、#2、#3快速染色试剂盒（Thermo Fisher，货号：9990700）；大前门牌过滤嘴香烟（烟碱含量0.8 mg，焦油量11 mg/支，上海烟草集团）。引物均来源于Invitrogen（Fisher Scientific），引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.1.2 仪器 多功能台式冷冻离心机（AllegraX-22R）；超微量紫外/可见分光光度计（赛默飞，Nanodrop 2000c）；PCR扩增仪（AppliedBiosystem）；荧光定量PCR仪（Ⅵ A7）；显微镜（BX61+DP720，Olympus）；细胞涂片离心机（Stat Spin CytoFuge12/IRIS）。

1.1.3 实验动物 SPF级6～8周龄BALB/c小鼠，雄性，体质量（20±2） g，由广东斯嘉景达生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（粤）2020-0052。饲养温度：（24±3） ℃，相对湿度：（40±5）%，光照：明暗交替，噪声＜55 dB，自由摄水摄食，每周更换垫料2次。本研究经广东省中医院伦理委员会批准（2021066）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 小鼠随机分为4组：对照组、熏烟组、poly（I：C）组、熏烟联合poly（I：C）组，每组6只。熏烟方法：小鼠适应性喂养3 d后，置于18 L塑料熏烟箱中，于9：00、12：00、15：00进行熏烟，3支/次，3次/d，1 h/次，共4 d，烟雾用60 ml注射器注入熏烟箱。假熏烟即每天按时置于18 L塑料箱，但不给予香烟烟雾暴露。poly（I：C）滴注方法：熏烟结束后第1天经异氟烷吸入麻醉，移液器经鼻孔滴入50 μl poly（I：C）（1 mg/ml），待小鼠清醒后置于笼内正常饲养。假滴注即在异氟烷麻醉后滴入50 μl生理盐水。对照组给予假熏烟和假滴注，熏烟组给予熏烟联合假滴注，poly（I：C）组给予假熏烟和poly（I：C）滴注，熏烟联合poly（I：C）组给予熏烟和poly（I：C）滴注。

1.2.2 气道灌洗液制备［3］小鼠用4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，切开气管处皮毛，充分暴露气管，经环状软骨间隙切开一小口，插入气管灌洗管（剪成楔形的24 G静脉留置针），分4次向气管内注射1.3 ml PBS并回抽，每只小鼠共回收约1 ml含免疫细胞的灌洗液。

1.2.3 支气管肺泡灌洗液细胞计数及细胞分类计数 将气道灌洗液混匀，加入20 μl AO/EB工作液混匀，将细胞计数板置于荧光显微镜下进行有核细胞计数。剩余含细胞的灌洗液根据细胞浓度用涂片离心机进行涂片离心，干燥后进行快速KWIKDIFF染色。按细胞形态学差异对细胞进行分类计数，获得不同种类细胞比例，计算每只动物灌洗液中不同种类细胞绝对数。

1.2.4 qPCR测定肺组织细胞因子 完成气管灌注后切开胸腹，充分暴露心肺，用5 ml生理盐水进行心脏灌流，洗去肺中残存血液，切下两侧肺，滤干水分，液氮速冻后-80 ℃保存。使用SteadyPure通用型RNA提取试剂盒提取肺组织总RNA，逆转录合成cDNA，按照剂盒说明书操作，2-ΔΔCt计算RNA相对表达。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0.2软件分析数据，计量资料以表示，多组间比较采用One-way ANOVA检验，两两比较采用Tukey检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 香烟烟雾联合poly（I：C）对气道灌洗液细胞总数和分类计数的影响 与对照组比较，熏烟联合poly（I：C）组小鼠气道灌洗液细胞总数（P＜0.01）、巨噬细胞数（P＜0.01）、中性粒细胞数（P＜0.01）和淋巴细胞数（P＜0.05）均明显升高。与熏烟组比较，熏烟联合poly（I：C）组小鼠气道灌洗液细胞总数（P＜0.01）、巨噬细胞数量（P＜0.05）、中性粒细胞数（P＜0.01）均显著升高（P＜0.01）。与poly（I：C）组小鼠相比，熏烟联合poly（I：C）组小鼠气道灌洗液细胞总数（P＜0.05）和巨噬细胞数（P＜0.05）显著升高（表2）。

表2 气道灌洗液细胞总数和分类计数（，n=6）Tab.2 Total number of cells and cell differentials in airway lavage fluid （，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with smoke group， 3）P＜0.05， 4）P＜0.01； compared with poly（I：C） group，5）P＜0.05.

Total lymphocytes（×105）0.03±0.00 0.09±0.02 0.32±0.061）3）0.23±0.061）4）Groups Control Smoke poly（I：C）Smoke+poly（I：C）Total cells（×105）1.27±0.22 2.26±0.35 4.29±0.861）7.28±0.782）4）5）Total macrophages（×105）1.09±0.19 1.89±0.26 1.84±0.43 3.49±0.322）3）5）Total neutrophils（×105）0.05±0.01 0.26±0.11 2.13±0.751）3）3.56±0.532）4）

2.2 香烟烟雾联合poly（I：C）对灌洗液中免疫细胞形态学的影响 对照组灌洗液以单核-巨噬细胞为主，偶见中性粒细胞和淋巴细胞。巨噬细胞胞体呈圆形，胞核呈圆形，深染；中性粒细胞通常呈杆状或2～3分叶状。熏烟组细胞以巨噬细胞为主，体积较对照组巨噬细胞稍大。poly（I：C）组小鼠气道灌洗液可见大量中性粒细胞和淋巴细胞，中性粒细胞核多呈明显的3～5分叶状，叶与叶间多有细丝相连，巨噬细胞数量相对较少，与对照组比较，体积较大。熏烟联合poly（I：C）组巨噬细胞体积较大，呈圆形或不规则形，细胞质内可见空泡，部分细胞处于有丝分裂期；中性粒较多，分叶状明显（图1）。

图1 香烟烟雾联合poly（I：C）对免疫细胞形态的影响（KWIK-DIFF快速染色，×200）Fig.1 Effects of cigarette smoke combined with poly（I：C）on immune cell morphology （KWIK-DIFF rapid staining，×200）

2.3 香烟烟雾联合poly（I：C）对肺组织趋化因子表达的影响 与对照组比较，熏烟联合poly（I：C）组小鼠肺组织中性粒细胞趋化因子CXCL1（P＜0.05）、CXCL2（P＜0.01）和淋巴细胞趋化因子CCL2（P＜0.01） mRNA表达均升高。与熏烟组比较，熏烟联合poly（I：C）组小鼠肺组织CXCL1（P＜0.05）、CXCL2（P＜0.01）、CCL2（P＜0.01） mRNA表达均显著升高。与poly（I：C）组小鼠比较，熏烟联合poly（I：C）组小鼠肺组织CXCL2 mRNA表达显著升高（P＜0.05，表3）。

表3 小鼠肺组织中趋化因子表达（，n=6）Tab.3 Expressions of chemokines in lung tissues of mice（，n=6）

表3 小鼠肺组织中趋化因子表达（，n=6）Tab.3 Expressions of chemokines in lung tissues of mice（，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with smoke group， 3）P＜0.05， 4）P＜0.01； compared with poly（I：C） group， 5）P＜0.05.

CCL2 mRNA 0.94±0.12 2.99±0.41 70.69±14.911）3）105.50±24.282）4）Groups Control Smoke poly（I：C）Smoke+poly（I：C）CXCL1 mRNA 1.10±0.13 3.70±0.63 22.40±7.39 37.06±9.731）3）CXCL2 mRNA 1.00±0.02 2.08±0.45 3.39±1.51 8.38±1.822）4）5）

2.4 香烟烟雾联合poly（I：C）对肺组织中细胞因子及MMP-12表达的影响 与对照组比较，熏烟联合poly（I：C）组小鼠肺组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达均明显升高（P＜0.01）。与熏烟组比较，熏烟联合poly（I：C）组小鼠肺组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达均明显升高（P＜0.01）。与poly（I：C）组比较，熏烟联合poly（I：C）组小鼠肺组织TNF-α mRNA表达明显升高（P＜0.01）。各组间MMP-12表达无明显变化（P＞0.05，表4）。

表4 小鼠肺组织中细胞因子及金属蛋白酶MMP-12表达（，n=6）Tab.4 Expressions of cytokines and metalloproteinase MMP-12 in lung tissues of mice （，n=6）

表4 小鼠肺组织中细胞因子及金属蛋白酶MMP-12表达（，n=6）Tab.4 Expressions of cytokines and metalloproteinase MMP-12 in lung tissues of mice （，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with smoke group， 3）P＜0.05， 4）P＜0.01； compared with poly（I：C） group，5）P＜0.01.

MMP-12 1.23±0.32 1.79±0.47 0.77±0.13 1.86±0.50 Groups Control Smoke poly（I：C）Smoke+poly（I：C）IL-1β mRNA 1.04±0.16 0.83±0.14 7.31±1.611）3）10.08±2.512）4）IL-6 mRNA 0.89±0.08 2.07±0.57 57.40±15.22）3）65.06±16.492）4）TNF-α mRNA 0.98±0.08 2.54±0.95 4.01±0.70 12.36±3.072）4）5）

2.5 熏烟联合poly（I：C）对小鼠肺组织干扰素及干扰素刺激基因表达的影响 与对照组比较，熏烟联合poly（I：C）组小鼠肺组织IFN-β（P＜0.01）、IFN-γ（P＜0.05）、MX2（P＜0.01）和IP-10（P＜0.01）表达显著升高。与熏烟组比较，熏烟联合poly（I：C）组小鼠肺组织IFN-β（P＜0.01）、IFN-γ（P＜0.01）、MX2（P＜0.01）和IP-10（P＜0.01）表达显著升高。且与单纯poly（I：C）组比较，熏烟联合poly（I：C）组小鼠IFN-β表达显著升高（P＜0.01，表5）。

表5 肺组织中干扰素表达及干扰素刺激基因转录（，n=6）Tab.5 Expressions of interferons and transcription of interferon-stimulated-genes in lung tissues （，n=6）

表5 肺组织中干扰素表达及干扰素刺激基因转录（，n=6）Tab.5 Expressions of interferons and transcription of interferon-stimulated-genes in lung tissues （，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with smoke group， 3）P＜0.01； compared with poly（I：C） group， 4）P＜0.01.

IP-10 1.02±0.12 1.81±0.31 90.23±33.08 153.52±30.882）3）Groups Control Smoke poly（I：C）Smoke+poly（I：C）IFN-α 1.38±0.78 1.40±0.50 1.07±0.25 1.88±0.66 IFN-β 1.41±0.83 1.29±0.49 3.81±1.18 10.67±2.222）3）4）IFN-γ 1.00±0.03 0.90±0.23 5.85±0.772）3）5.04±1.161）3）IFN-λ 1.30±0.67 1.52±0.70 1.48±0.68 1.79±0.49 OAS1 1.06±0.25 1.34±0.66 1.59±0.40 1.31±0.25 MX2 1.01±0.10 1.38±0.50 7.68±1.572）3）9.39±1.032）3）

3 讨论

吸烟可诱导气道炎症并导致气道结构不可逆破坏。poly（I：C）是人工合成的双链RNA，可模拟病毒感染并通过激活TLR3引发抗病毒免疫应答，产生Ⅰ型干扰素和炎症细胞因子发挥抗病毒作用［4］。poly（I：C）本身具有强烈促炎作用以及增强巨噬细胞吞噬、杀菌等功能，广泛用于病毒引起的宿主免疫应答研究［5］。尽管短期香烟暴露并未导致肺组织结构破坏，但课题组前期研究表明，4 d香烟烟雾暴露可诱导气道免疫细胞聚集和肺组织炎症反应［3］，因此本研究揭示香烟暴露诱导的气道免疫应答与poly（I：C）诱导的气道免疫应答的叠加效应，从而反映吸烟人群在病毒感染过程中的免疫应答变化以及吸烟对呼吸道病毒感染免疫应答的影响。

巨噬细胞和中性粒细胞是固有免疫屏障的重要组成，可吞噬清除病原微生物和气道中的有害颗粒［6］。淋巴细胞可介导被感染细胞的免疫应答，通过细胞毒性T淋巴细胞对细胞进行杀伤或诱导适应性免疫应答，诱导干扰素产生。本研究表明，香烟暴露4 d导致小鼠气道灌洗液细胞数量轻度升高，未出现明显炎症反应，可能由于香烟暴露第5天接受了假气道滴注，24 h后进行取材，此时短期香烟暴露导致的气道急性炎症反应有所衰减。相比于poly（I：C）组，熏烟联合poly（I：C）组气道灌洗液中细胞总数明显增多，主要为巨噬细胞增多，而中性粒细胞和淋巴细胞变化差异无统计学意义。提示香烟烟雾加剧了poly（I：C）对巨噬细胞的趋化和募集，这一过程可能更有利于微生物清除。

免疫细胞在炎症部位聚集是诱导炎症反应的基础，而趋化因子是诱导免疫细胞移动、回巢和聚集的关键［7］。本研究中，熏烟联合poly（I：C）组小鼠肺组织单核-巨噬细胞趋化因子CCL2和IP-10表达较其余各组有不同程度升高，解释了熏烟联合poly（I：C）组小鼠气道灌洗液中巨噬细胞数量明显增多的原因。巨噬细胞分泌的多形核细胞趋化因子CXCL2表达较poly（I：C）组小鼠明显升高，说明气道中巨噬细胞可能通过增加CXCL2表达进一步加剧中性粒细胞招募，从而促进“炎症瀑布”形成。

IL-6、TNF-α、IL-1β是常见的促炎因子，均可参与炎症反应发生。IL-6是最早升高的急性炎症标志物。TNF-α、IL-6和IL-1β能引起内皮细胞损伤、介导炎症反应并参与机体免疫调节，同时促进炎症细胞活化与浸润，增强炎症介质诱导的呼吸道黏液细胞高分泌状态，引发支气管狭窄、收缩等气道高反应性［8-9］。本研究表明，气道滴注poly（I：C）24 h后，小鼠肺组织IL-6、IL-1β mRNA表达明显升高，说明小鼠气道处于急性炎症反应阶段。而熏烟联合poly（I：C）组小鼠IL-6、IL-1β mRNA表达略高于poly（I：C）组，且TNF-α mRNA表达明显高于poly（I：C）组，说明香烟烟雾暴露加剧了poly（I：C）诱导的小鼠肺部急性炎症反应，且熏烟联合poly（I：C）组小鼠气道灌洗液中性粒细胞较多，巨噬细胞胞质内产生大量吞噬空泡，说明熏烟联合poly（I：C）组小鼠气道炎症反应加剧。

干扰素是抑制病毒复制的重要介质，根据产生细胞不同可分为IFN-α、IFN-β和IFN-γ，近年还发现了IFN-λ，也称Ⅲ型IFN，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。IFN-α和IFN-β被归为Ⅰ型IFN，能在病毒感染早期抑制病毒复制［10］。IFN-γ即Ⅱ型IFN，是一种免疫调节因子而非抗病毒介质［11］。本研究中，熏烟联合poly（I：C）滴注显著升高了IFN-β表达，其水平高于单独poly（I：C）滴注组，说明香烟烟雾暴露促进了poly（I：C）诱导的Ⅰ型IFN表达。Ⅰ型IFN可通过与IFN受体（IFNAR）结合促进下游IFN刺激基因转录，如OAS、MX和IP-10等。OAS1可调节核糖核酸酶L的抗病毒活性，导致病毒RNA降解，抑制病毒复制［12-13］。MX蛋白可通过蛋白寡聚和GTP酶水解抑制RNA和DNA病毒复制［14］。IP-10具有促进T细胞黏附内皮细胞、抗肿瘤活性和抑制骨髓集落形成和血管生成作用，也是有力的巨噬细胞趋化因子，参与COVID-19诱导的炎症风暴［15-16］。本研究表明，香烟烟雾暴露联合poly（I：C）气道滴注显著增加了小鼠肺部MX2和IP-10表达，提示香烟烟雾暴露联合poly（I：C）滴注促进了IFN刺激基因表达，可能因此抑制病毒复制和促进炎症风暴。

综上，短期香烟烟雾暴露可能通过增加poly（I：C）诱导的气道巨噬细胞数量和Ⅰ型IFN表达促进呼吸道病毒清除，同时增加了poly（I：C）诱导的气道炎症反应，加剧气道损伤和重构。

本研究结果并未提示香烟烟雾可通过抑制Ⅰ型IFN表达增加呼吸道病毒感染，与既往研究结果不一致，其原因可能与本次香烟暴露时间较短有关［17-18］。同时提示香烟烟雾可能通过其他途径影响呼吸道病毒感染，为进一步研究提供了依据。