镁合金表面白藜芦醇诱导羟基磷灰石涂层的制备与表征

2024-01-24朱博武李都红刘娅丽

材料保护 2024年1期

朱博武，李都红，刘娅丽

(1.兰州大学口腔医学院，甘肃兰州 730000；2.西北民族大学医学部，甘肃兰州 730030)

0 前言

钛及钛合金因为具有优异的抗腐蚀性能、良好的综合力学性能以及易加工成型等特点，成为了临床骨科、口腔科等常规使用的植入材料。然而，这些植入材料存在着应力遮挡效应、炎症反应、异物反应、二次手术取出等一系列问题[1-4]。镁及镁合金因为具备与人体骨骼相似的力学性能、可降解性以及生物相容性良好等显著优势[5-7]，成为了可降解金属骨植入物的热门选择。但是，镁及镁合金在潮湿环境中，特别是在含有氯离子的人体生理环境内会快速腐蚀[8]，这也使得镁合金组织结构易被破坏，力学性能容易受损，无法满足临床对医用植入材料机械强度的需求[9，10]。为克服这些不足，一些学者提出通过应用骨整合或骨诱导性能良好的生物材料对镁合金表面进行功能化处理以提高材料的耐腐蚀性和细胞相容性[11]。

仿生矿化在20 世纪90 年代被首次提出，其是指利用与人体血液有相似的离子成分以及pH 值的模拟体液，在生物材料表面制备羟基磷灰石(HA)。研究表明，HA 具备与天然骨相似的无机结构，可以增强钛合金与生物体周围组织的骨结合能力[12]。仿生矿化具有制备过程简单、不受限于材料本身[13]等优点。仿生矿化法在应用时可以在涂层中添加骨生长刺激因子以促进成骨，同时也可以在医用生物材料表面诱导制备出类骨样涂层[14]。但是，如果缺乏HA 的成核中心，那么采用仿生矿化法在纯AZ31 镁合金表面直接制备HA涂层是相当困难的[15]。考虑到临床对植入材料力学性能和化学稳定性的要求，采用直接沉积的方法制备的涂层，其力学性能和化学稳定性显然是不足的[16]。有研究显示，可以采用具备骨诱导性能良好的有机添加剂来诱导和促进HA 的“生长”[17，18]。

白藜芦醇(简写为BLLC)是一种具备强抗炎特性的抗氧化剂，能够抵抗与衰老以及氧化等相关的疾病，同时白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，而该类化合物具备诱导和促进羟基磷灰石涂层形成的作用。研究显示，白藜芦醇具备抗炎的作用，其机制是白藜芦醇可以降低血小板的黏附，白藜芦醇还能促进骨骼的生长[19，20]。

目前，在镁合金表面制备羟基磷灰石-白藜芦醇复合涂层鲜有报道。本研究拟利用骨诱导性能良好的生物材料白藜芦醇通过仿生矿化的方法在AZ31 镁合金表面制备含白藜芦醇-羟基磷灰石(BLLC-HA)的复合涂层并评估其耐腐蚀性和细胞相容性，以期制备一种可生物降解的医用材料。

1 试验

1.1 样本准备

根据实验要求将AZ31 镁合金试样切割成10 mm×10 mm×1 mm 的规格，AZ31 镁合金的化学成分如表1所示。样品用600，800，1 000，1 200 目SiC 砂纸按顺序依次进行机械打磨和抛光，然后分别使用丙酮和无水乙醇交替超声清洗5 min，最后使用去离子水清洗，并在室温下干燥备用。该样品被定义为AZ31。

表1 AZ31 镁合金成分Table 1 Composition of AZ31 magnesium alloy

AZ31 样品在制备白藜芦醇涂层之前，先使用1 mol/L NaOH 溶液将样品浸泡24 h，并且在150 ℃马弗炉中加热1 h 实现镁合金表面的钝化[21，22]。然后采用无水乙醇溶解白藜芦醇，配制成4 mg/mL 的白藜芦醇溶液，接着采用该白藜芦醇溶液浸泡AZ31 镁合金，在保持37 ℃的条件下连续磁力搅拌浸泡24 h，最后采用去离子水冲洗样品，并且在室温下干燥备用。该样品被定义为AZ31-BLLC。

依据Cui 等[21]的描述方法制备钙磷溶液:依次称取1.652 g Ca(NO3)2，0.655 2 g NaH2PO4和0.168 g NaHCO3加入到500 mL 的去离子水中充分溶解后备用。然后将含白藜芦醇涂层的AZ31 镁合金浸泡于钙磷溶液中制备羟基磷灰石(HA)涂层，浸泡时间为48 h以帮助钙磷晶体的生长，钙磷溶液温度需要保持在37℃，每24 h 更换一次溶液。最后采用去离子水冲洗样品，并在室温下晾干备用。该样品被定义为AZ31 -BLLC-HA。同时，将纯AZ31 镁合金依据上述方法直接浸泡在配好的钙磷溶液中形成羟基磷灰石涂层作为对照组，该组样品被定义为AZ31-HA。

1.2 样本形貌和成分特征表征

采用nSM-5600LV 型扫描电子显微镜(SEM)观察涂层表面微观形貌，采用HitachiS-4800 型能量色散X射线光谱仪(EDS)分析涂层元素含量，采用D/Max-2400 型X 射线衍射仪(XRD)观察涂层相组成，采用NEXUS 670 型傅里叶红外光谱分析仪(FT-IR)分析涂层特征性官能团。X 射线衍射仪选择Cu-K 辐射(λ＝1.541 81 nm)，在室温情况下进行，选择20°～80°的测试角度(2θ)，测试电压设置为40 kV，电流设置为150 mA，步长设置为0.02°。傅里叶红外光谱分析仪测试范围设置为4 000～500 cm-1，在室温下进行。

1.3 样本耐腐蚀性评估

样本的耐腐蚀性采用动电位极化测试和氢气释放试验来评估，在模拟体液(SBF)中完成。依据Kokubo等所描述的方法配制模拟体液(SBF)[22]，SBF 配比如表2 所示。动电位极化测试采用PGSTAT 302N 三电极电化学工作站完成。样本、铂板和Ag/AgCl 电极(饱和氯化钾)分别为工作电极、对电极和参比电极。在电化学测量前，采用模拟体液(SBF)将样品浸泡180 s 以建立开路电位，电化学工作站的恒定扫描速率设置为1 mV/s，测试样品在模拟体液(SBF)中的暴露面积为0.5 cm2。为了确保实验结果的重复性和可靠性，测试样品电化学测量均重复3 次。

表2 配制800 mL SBF 溶液的试剂及用量Table 2 Reagents and dosage of 800 mL SBF solution

按照Bakhheshi-Rad 等[23]描述的方法，采用氢气释放测试来评估样本的耐腐蚀性。每间隔24 h 用新配制的模拟体液(SBF)代替原来的溶液，同时记录此段时间样品释放的氢气体积，各组样品试验共进行7 d，各组样品试验均重复3 次。

1.4 细胞增殖测定和细胞形态学检查

选择MC3T3-E1 细胞来评价细胞增殖和细胞形态，采用DMEM 培养基培养细胞，在DMEM 中加入1%链霉素和青霉素及10%(体积分数)胎牛血清。在37℃，含5%的CO2条件、型号为MCO-170/CL-PC 的湿式培养箱中培养。通过将不同样本浸泡在DMEM 中制备浸提液，浸提比例为1 cm2/mL[24]。在96 孔板(每孔104 个细胞)中培养细胞24 h。采用DMEM 培养基培养MC3T3 - E1 细胞作为阴性对照组，样本组是将DMEM 换成浸提液。培养1、4 和7 d 后采用MTT 法测定MC3T3-E1 细胞的增殖率。采用非配对单尾t 检验对数据进行统计学检验，P＜0.05 被认为具有统计学差异。使用型号为ICX41 的倒置光学显微镜来获得细胞培养照片。

2 结果与讨论

2.1 样品表征

AZ31、AZ31-BLLC、AZ31-HA 和AZ31-BLLC-HA 的表面形貌及AZ31-BLLC-HA 的截面形貌如图1 所示。

图1 AZ31、AZ31-BLLC、AZ31-HA 和AZ31-BLLC-HA 的表面及AZ31-BLLC-HA 的截面SEM 形貌Fig.1 SEM images of the surfaces of AZ31，AZ31-BLLC，AZ31-HA and AZ31-BLLC-HA and the cross-section of AZ31-BLLC-HA

与AZ31(图1a)相比，AZ31-BLLC(图1b)材料表面没有观察到划痕且表面有均匀一致的新的物质，这说明白藜芦醇被成功地浸涂到AZ31 镁合金表面。AZ31-HA(图1c)材料表面存在大块的磷酸钙晶体，形态不一致。然而，AZ31-BLLC-HA(图1d)材料表面是草丛状、多孔的和均匀一致形貌，它是由一致的薄片状晶体构成，这些多孔结构有利于诱导骨磷灰石形成等骨细胞的生物学反应，进而刺激成骨细胞的增殖[25]。依据Gopi 等[26]的研究，材料表面多孔结构可能是由于涂层形成过程中氢气的释放引起的。与AZ31-HA 相比，AZ31-BLLC-HA 组表面的羟基磷灰石涂层更加均匀一致，未发现大块的磷酸钙晶体，这可能是由于白藜芦醇诱导和促进了羟基磷灰石的成核和结晶过程[18]。从AZ31-BLLC-HA 的截面形貌(图1e)可以观察到复合涂层紧密附着于AZ31 镁合金表面，内部结构相对致密、均匀。

AZ31-BLLC、AZ31-BLLC-HA 表面的EDS 元素含量分析结果如图2 所示。在AZ31-BLLC 表面C、O 元素被检测到，这表明在AZ31 的表面有一个新的涂层。与AZ31-BLLC 相比，在AZ31-BLLC-HA 表面检测到了新元素Ca 和P，经计算可知，Ca/P 原子比达1.43，与羟基磷灰石的原子比(1.67)相近。但是Ca/P 相对较低也说明了在羟基磷灰石(HA)涂层中钙含量是不够的，推测可能是由于少量的镁离子取代了羟基磷灰石中的钙离子[27]。Ren 等[28]的研究表明，这种替代是有利于模仿自然骨组织的。

图2 AZ31-BLLC 和AZ31-BLLC-HA 的EDS 结果Fig.2 The EDS results of AZ31-BLLC and AZ31-BLLC-HA

各样本的XRD 结果如图3 所示。除AZ31 镁合金峰被观察到外，氢氧化镁的峰在2θ＝57.4°处也被检测到，这可能是由于镁合金表面形成的涂层中含有Mg(OH)2。与AZ31 组相比，AZ31-BLLC 组没有观察到明显的差异，推测可能是因为白藜芦醇膜相对较薄且是非晶态[23]。但是在AZ31-BLLC-HA 表面除了观察到镁的特征峰外，也观察到新的尖而窄的特征峰，在2θ＝25.9°、29.3°和53.4°处，分别可以观察到有来自羟基磷灰石的(002)、(210) 和(004) 的反射[24]。与AZ31-BLLC-HA组类似，AZ31-HA 组在2θ＝ 25.9°、29.3°和53.4°处也观察到羟基磷灰石晶面的反射，这表明在AZ31-BLLC-HA 和AZ31-HA 表面有羟基磷灰石涂层形成。

图3 AZ31、AZ31-BLLC、AZ31-HA 和AZ31-BLLC-HA 的XRD 谱Fig.3 The XRD results of AZ31，AZ31-BLLC，AZ31-HA and AZ31-BLLC-HA

纯BLLC、AZ31-BLLC、AZ31-HA 和AZ31-BLLCHA 的FT-IR 光谱如图4 所示。同其他组相比较，观察到AZ31-BLLC-HA 在1 031-1、594-1和556 cm-13 处出现了磷酸盐峰(PO43-)，推测磷酸盐峰(PO43-)的出现可能是因为AZ31-BLLC 表面形成羟基磷灰石，由羟基磷灰石涂层中磷酸盐基团所产生[24]。以上结果表明，在AZ31-BLLC 表面成功制备出羟基磷灰石涂层，此结果与XRD 研究结果相一致。同时，AZ31-BLLC-HA 组在1 650 cm-1处观察到碳酸盐峰(CO32-)，推测可能是因为羟基磷灰石中含有少量碳酸盐基团。

图4 纯BLLC、AZ31-BLLC、AZ31-HA 和AZ31-BLLC-HA 的FT-IR 光谱Fig.4 The FT-IR profiles of pure BLLC，AZ31-BLLC，AZ31-HA and AZ31-BLLC-HA

以上表征结果表明，通过白藜芦醇的诱导，在AZ31 镁合金表面成功制备出形貌基本均匀一致的羟基磷灰石涂层(HA)。羟基磷灰石涂层形成机理可能是因为含羟基的白藜芦醇吸附了溶液中的Ca2+，从而在涂层表面形成了正电荷基团，随后溶液中的许多带负电的基团(如OH-、PO43-等)与钙离子相结合，进而在AZ31 镁合金表面形成羟基磷灰石涂层，这与其他学者的研究基本一致[29]。

2.2 耐腐蚀性评估

AZ31、AZ31-BLLC、AZ31-HA 和AZ31-BLLC-HA在室温条件下的动电位极化曲线如图5 所示。由图5可知，AZ31、AZ31-HA 和AZ31-BLLC 的自腐蚀电位(Ecorr)分别为-1.399 V、-1.323 V 和-1.338 V，而AZ31-BLLC-HA 的自腐蚀电位为-1.152 V，明显高于其他3 组。另外，依据Tafel 拟合可知AZ31-BLLCHA、AZ31-HA、AZ31-BLLC 和AZ31 的相应腐蚀电流密度(Jcorr)分别为3.47×10-10、1.82×10-8、1.17×10-7、7.41×10-7A/cm2，见表3。

图5 AZ31、AZ31-BLLC、AZ31-HA 和AZ31-BLLC-HA在SBF 溶液中室温下的动电位极化曲线Fig.5 Dynamic potential polarization curves of AZ31，AZ31-BLLC，AZ31-HA and AZ31-BLLC-HA in SBF solution at room temperature

表3 各组样品在SBF 溶液下的腐蚀电压(Ecorr)和腐蚀电流密度(Jcorr)Table 3 Corrosion voltage (Ecorr) and corrosion current density (Jcorr) of the samples under SBF solution

同AZ31 组相比，AZ31-BLLC-HA 组的腐蚀电位值增加了约247 mV，腐蚀电流密度值降低了3 个数量级。这表明羟基磷灰石-白藜芦醇复合涂层显著提高了AZ31 镁合金的耐腐蚀性，这可能是由于羟基磷灰石-白藜芦醇复合涂层可以有效阻止AZ31 镁合金表面与腐蚀离子相接触。

AZ31、AZ31-BLLC、AZ31-HA 和AZ31-BLLC-HA组在SBF 溶液中的累积氢气释放量-时间曲线如图6所示。AZ31-HA、AZ31-BLLC 和AZ31 的平均氢气释放率分别为0.50、1.16，1.41 mL/(cm2·d)。与其他组相比，AZ31-BLLC-HA 平均氢气释放率最小的，其平均氢气释放率为0.41 mL/(cm2·d)，说明羟基磷灰石-白藜芦醇复合涂层可以有效地减少AZ31 镁合金在模拟体液(SBF)中的降解率。因此，AZ31 镁合金表面的羟基磷灰石-白藜芦醇复合涂层作为一种保护层，可以明显提高AZ31 镁合金的耐腐蚀性。

图6 AZ31、AZ31-BLLC、AZ31-HA 和AZ31-BLLC-HA在SBF 溶液中累积氢气释放量-时间曲线Fig.6 Curves plot of the cumulative hydrogen release vs time of AZ31，AZ31-BLLC，AZ31-HA and AZ31-BLLC-HA in the SBF solution

2.3 细胞相容性评估

本工作采用MTT 法和细胞形态观察来评估改性后AZ31 镁合金的细胞相容性。图7 显示了AZ31、AZ31-BLLC、AZ31-HA 和AZ31-BLLC-HA 组的细胞增殖率。

图7 AZ31、AZ31-BLLC、AZ31-HA 和AZ31-BLLC-HA 的细胞增殖率Fig.7 The cell proliferation rates of AZ31，AZ31-BLLC，AZ31-HA and AZ31-BLLC-HA

研究表明，各组细胞在1 d、4 d 和7 d 内的细胞增值率均高于80%，这表明样品毒性很低，具有良好的细胞相容性。在培养1、4 和7 d 后AZ31-BLLC-HA 组的细胞增殖率均显示最高，而且明显高于阴性对照组。同时，AZ31-HA 组的也明显高于AZ31、AZ31-BLLC 组的，说明HA 涂层可以明显促进细胞增殖。因此，可以推测羟基磷灰石-白藜芦醇复合涂层是一种生物活性膜，该复合涂层可以明显促进MC3T3-E1 细胞的增殖，这可能是由于羟基磷灰石涂层中溶解的离子促进了MC3T3-E1 细胞的增殖和分化[30]。

图8 是MC3T3 -E1 细胞在AZ31、AZ31 -BLLC、AZ31-HA 和AZ31-BLLC-HA 浸提液和DMEM 培养液中培养1、4、7 d 后的细胞形态照片。在培养1、4、7 d后，与AZ31(图8a)相比，其余各组的细胞数量均有增加，此结果与MTT 法测量的细胞增殖率一致。此外，AZ31-BLLC-HA(图8d) 细胞数量是最多的。从细胞形态来看，AZ31-BLLC-HA(图8d) 细胞形态更加规律一致，表明含羟基磷灰石-白藜芦醇复合涂层的AZ31 镁合金具有良好的细胞相容性。另外，AZ31-HA(图8c)细胞数量也明显多于AZ31(图8a)、AZ31-BLLC(图8b)，说明HA 涂层可以显著提高材料的细胞相容性。

图8 MC3T3-E1 细胞在各组浸提液和DMEM 培养液中培养1，4，7 d 后的倒置显微镜形貌(20×)Fig.8 Inverted microscope images of MC3T3-E1 cells cultured in extracts and DMEM media for 1，4 and 7 d (20×)