猪流行性腹泻病毒SCYA2204 株的基因克隆及测序分析

孔晶晶，田珺劼，任玉鹏*，陈弟诗，包 昕

（1.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041；2.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041）

猪流行性腹泻（PED）由冠状病毒科Alpha 冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起，PEDV 对各日龄猪都具有易感性，对2 周龄内仔猪的致死率可达100%［1］。PEDV 为单股正链RNA 病毒，全基因组序列大小约为28 kb，包含5′端帽子结构，3′端poly（A）尾及7 个开放阅读框（ORF），共编码纤突蛋白（S蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和核衣壳蛋白（N蛋白）等四种结构蛋白，以及ORF1ab 复制酶多聚蛋白和ORF3蛋白等非结构蛋白［2］。S蛋白是PEDV重要的毒力蛋白，它所构建的系统进化树可将PEDV划分为G1和G2两个型，其中G2型包含G2a、G2b和G2c 亚型［3］，我国目前流行的毒株主要是G2a、G2b 亚型。监测S 基因的遗传变异对PED 的防控施策具有重要意义［4］。此外，PEDV的ORF3蛋白是唯一的非结构辅助蛋白。在PEDV连续传代弱化毒株中，ORF3 基因存在17 个连续氨基酸的稳定缺失，可能与其毒力弱化有关［5］。E 蛋白主要调控病毒组装、胞内运输和病毒释放等过程，还能引起内质网产生应激，并促使宿主细胞产生白细胞介素-8（IL-8）、B-细胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2），造成细胞损伤和诱导细胞凋亡［6］。M 蛋白位于整个细胞质中，通过与S 蛋白和N 蛋白相互作用在病毒核衣壳的组装过程中发挥重要作用，对细胞增殖和病毒复制具有重要影响。N蛋白是一种高度保守的磷蛋白［7］，是PEDV核衣壳的基础结构，在病毒复制、组装过程中发挥重要作用。

本研究对四川省雅安地区流行的一株PEDV SCYA2204的S基因、ORF3基因、E基因、M基因和N基因进行基因克隆及测序，分析病毒基因核苷酸序列，并推导氨基酸序列的变异性及遗传进化特征，以期为PEDV 的有效防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Trizol、反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、pMD19-T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞、DL2000 DNA Marker、胶回收试剂盒。

1.2 临床样本来源与处理 临床样本于2022年4 月采自四川省雅安市某规模化猪场，用无菌棉签采集疑似PEDV 感染猪的肛门棉拭子，低温保存于DMEM 基础培养基中。将样本用适量PBS 稀释后反复冻融3 次，在高速冷冻离心机上以10 000 r/min 离心15 min，取上清液。样本由西南民族大学动物医学实验室进行RT-PCR 检测，确定为PEDV阳性样本，并冻存于-80 ℃冰箱。

1.3 引物设计 PEDV S 基因、ORF3 基因和M 基因的引物均参照文献［8-9］合成，其中对S基因采用分段重叠法，分4 段（S1、S2、S3、S4）进行测序。E 基因、N 基因的引物以GenBank 中CV777、AJ1102毒株的基因组序列为参考，运用引物设计软件Primer Primier 5.0设计。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。

表1 PEDV扩增引物信息

1.4 RNA 提取与反转录 使用Trizol 法提取上述样品的总RNA。参照反转录试剂盒说明书将RNA 反转录为cDNA，所得cDNA 于-20 ℃冻存备用。

1.5 目的基因的PCR 扩增 25 μL PCR 扩增加样体系：ddH2O 10.5μL，2×PCR MasterMix 12.5μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。反应条件：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，退火30 s（退火温度参照表1设置），72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.6 基因的克隆及测序 根据Omega 生物技术公司胶回收试剂盒说明书进行回收纯化。参照pMDTM19-T Vector Cloning Kit说明书进行连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的牛肉膏蛋白胨培养基（100 μg/mL Amp LB）琼脂上筛选阳性克隆，送样至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.7 基因序列的生物信息学分析 选取62株国内外PEDV毒株，其中28株国外毒株，包括2株常用疫苗毒株AJ1102、CV777（GenBank登录号分别为JX188454、AF353511）；34株国内毒株，包括14株往年四川地区流行的毒株。用SeqMan 软件对基因片段进行拼接，将各基因序列在NCBI 中比对，在MegAlign软件中用Clustal W法计算各基因的核苷酸同源性；用MEGA 11 软件中Neighbor-Joining法构建系统进化树；使用Alignment Report分析各基因的变异性及S基因推导的氨基酸的变异性；利用RDP4软件中的7种不同程序方法对S基因序列的重组信号进行检测。

2 结果

2.1 PEDV 基因的克隆测序 对PEDV S 基因、ORF3基因、E基因、M基因和N基因进行扩增，获得与预期大小相符的条带（图1）。将PCR产物克隆测序，对S 基因重叠的区域进行拼接，得到PEDV S 基因的总长度为4 161 bp，ORF3 基因、E基因、M 基因和N 基因序列的长度分别为675、231、681、1 326 bp。将此毒株命名为SCYA2204。

图1 PEDV基因各片段的RT-PCR扩增产物

2.2 PEDV 基因的同源性分析 与参考毒株相比，SCYA2204 S基因的核苷酸同源性为92.5%～99.2%，其中与四川毒株CH/SCXH/2018的核苷酸同源性最高，为99.2%；与经典疫苗株CV777 S基因的核苷酸同源性为93.2%，与AJ1102 S基因的核苷酸同源性为96.8%，而与四川近年流行毒株（SCDY/05/2020、SCDZ-1/2020、SCXH/2018、SCYB/2018、SC/CY/2022、SC2021 等）的同源性高达98.1%～99.2%。另外，ORF3 基因、E 基因、M基因和N 基因的核苷酸同源性分别为96.0%～100%、97.0%～100%、97.4%～99.7%、95.2%～99.9%。其中，SCYA2204 与美国地区IA1、NPLPEDV/2013和中国地区LYG等毒株ORF3基因的核苷酸同源性最高；与中国地区SC2021、CH/JXJA/2017 和国外地区IA1、ON-018 等毒株E 基因的核苷酸同源性最高，均为100%；与SC2021、HK2021 M基因的核苷酸同源性最高，为99.7%；与HN2021、SD2020、NH-TA2020 N 基因的核苷酸同源性最高达99.9%（表2）。

表2 PEDV SCYA2204株各基因同源性分析

2.2 PEDV基因的遗传进化树分析 由S基因构建的遗传进化树（图2）将所有PEDV分为G1、G2a和G2b 三个亚型，SCYA2204 与28 株PEDV 国内外流行毒株同属于G2b亚型。其中SCYA2204与四川往年流行毒株CH/SCYB-1/2018、CH/SCNJ-1/2020、CH/SCXH/2018、SWUN-C6-CH-SCYA-2019、SWUN-Y1-CH-SCCQ-2019 聚成一支，亲缘关系密切，与SC2021的亲缘关系相对较远。此外，常用疫苗株AJ1102 属于G2b 亚型，CV777 和DR3 属于G1a 亚型，与SCYA2204 的亲缘关系都比较远。

图2 S基因的遗传进化树分析

由ORF3 基因构建的系统发育树（图3A）可见，SCYA2204 与CH/SXWS/2018、PEDV-LYG 的亲缘关系较近，与四川往年流行毒株SC2021、CH/SCAZ10/2017 的亲缘关系均相对较远。此外，由于CV777、AJ1102 和DR13 为弱毒疫苗株，其ORF3 基因均存在50 bp 碱基缺失，因此，三个毒株的ORF3基因序列与其他毒株的均不在同一分支。由E基因遗传进化树（图3B）可见，河南毒株HN2021、山东毒株SDTA13-2020、四川毒株SC2021 等都与SCYA2204 的亲缘关系极其密切。在M基因遗传进化树（图3C）中，四川往年流行毒株SC2021、国内流行毒株HK2021、江西流行毒株JX2020 与SCYA2204 聚成一支，亲缘关系极其密切。在N基因遗传进化树（图3D）中，河南毒株HN2021、国内毒株TRS2021与SCYA2204的亲缘关系密切，三株山东毒株NH-TA2020、SD2020、SDTA13-2020 与SCYA2204 的亲缘关系也较为密切，而四川往年流行毒株SC2021 与SCYA2204的亲缘关系则相对较远。E基因、M基因和N 基因的系统发育树均提示经典疫苗株CV777、AJ1102与SCYA2204的亲缘关系较远。

图3 ORF3、E、M、N基因的遗传进化树分析

2.3 PEDV S 蛋白的变异性分析 将SCYA2204毒株S 基因推导的氨基酸序列与常用疫苗毒株CV777、AJ1102 及四川往年流行毒株SC2021、SCDZ-1/2020、SCCY2022、CH/SCDY/05/2020作比较，共有10 处氨基酸（AA）突变，其中存在3 处连续AA 突变，分别为PC700/701LW、QA706/707HY、DDIV712/713/714/715HNTP。与CV777 相比，共有83处AA 突变，其中17 处为连续AA 突变：TP2/3KS、GSTI27/28/29/30SANT、SMNS55/56/57/58IGEN、GTGIE68/69/70/71/72AGQHP、DS86/87RG、DN130/131SI、VN148/149AD、LQD157/158/159HMS、KNI161/162/163EHS、KRS200/201/202SGG、EP229/230QL、DS246/247EP、PC700/701LW、QA706/707HY、DDIV712/713/714/715HNTP、GD1177/1178DE、TY1197/1198NH；在59～63 位存在4 个氨基酸插入（QGVN），在134位存在一个氨基酸插入（N），160位存在一个氨基酸的缺失（G）。与AJ1102 株比较，共有34 处AA 突变，其中3 处为连续突变：PC696/697LW、QA702/703HY、DDIV708/709/710/711HNTP，30处为点突变，1处在1 198位插入（H）。

S 基因编码的S 蛋白能够诱导机体产生中和抗体。研究显示［10］，S 蛋白含有的抗原中和表位包括COE（499～638 AA）、SS2（748～755 AA）、SS6（764～771 AA）、2C10（1 368～1 374 AA）。与CV777 比较（图4），SCYA2204 的中和表位共有7处AA 突变：A521S、F540L、T553S、G598S、Q637E、L768S、D770S，其中COE 区有5处突变：A521S、F540L、T553S、G598S、Q637E，SS6区有2 处突变：L768S、D770S。与AJ1102比较，SCYA2204 的中和表位共有3 处AA 突变：T500I、A521S、F540L，其中COE区A521S、F540L两处突变为SCYA2204 与AJ1102、CV777 共有的AA 突变。SCYA2204的SS 区 与CV777 和AJ1102 比 较，均无突变。

图4 S蛋白中和表位的比对分析

2.4 PEDV S 基因的重组分析 运用RDP4软件中的7个不同程序方法（RDP、MaxChi、GENECONV、BootScan、Chimaera、SiScan 和3Seq）对S 基因序列的重组信号进行检测，结果发现：SCYA2204与41株参考毒株的S基因之间存在1个潜在重组事件，7种重组检测方法中有6种皆呈阳性，发生概率较高。主要亲本为G2b亚型的CH/SCXH/2018，次要亲本基于G1 亚型的LZC株推导，重组区域在S基因的2108～2237 bp。

3 讨论

目前PEDV 仍广泛流行于全国各地。Zhang Hao 等［11］对2011～2021 年华中、华南和华东地区共计149 869 例腹泻猪组织样本进行检测，结果表明PEDV 仍然是过去11 年引起国内猪腹泻病的最主要病原，流行率为61.8%。虽然当前几种商品化的弱毒疫苗和灭活疫苗已被广泛用于PED 的防控，但由于PEDV 基因组的高度变异性导致其基因亚型不断增加，基因重组事件频发，造成毒株间的交叉保护效果差，如：研究已证实基于G1 型毒株研制的疫苗（CV777）已无法对G2a和G2b 亚型的PEDV提供良好的保护［12］；且不同G2 亚型毒株间的交叉保护效果也有差异［13］。据调查显示，PEDV 在国内不同地区的优势基因型有较大差异［14］；同时，当前四川地区流行的PEDV 毒株的变异性和基因多样性在不断增加。本次四川雅安地区流行的SCYA2204株属于G2b 亚型，其S 基因发生了较大的变异。与CV777 比较，SCYA2204 有17 处连续AA 突变，且SCYA2204 株S 蛋白存在3 处独特的连续AA 突变，与国内近几年流行毒株（SC2021、SCDZ-1/2020、SCCY2022、CH/SCDY/05/2020 等）的S 蛋白氨基酸序列有明显差异。研究表明，PEDV S 基因包括多个病毒主要的中和表位和受体结合域，它们与病毒的抗原性和吸附入侵密切相关［10］，在病毒—宿主细胞膜融合的信号转导过程中起着重要作用［15］，其融合活性也决定了病毒的组织嗜性和细胞感染能力。本研究中，将SCYA2204 株与CV777株的4个当前已鉴定的S蛋白中和表位比较，SCYA2204 株中和表位共有7 处AA 突变；与AJ1102 比较，SCYA2204 株的中和表位有3 处AA突变。其中，COE区的A521S、F540L两处突变为SCYA2204 与AJ1102、CV777 共有的AA 突变。SCYA2204 株的氨基酸变化，尤其是中和表位区内的变异，可能导致其抗原性发生改变，影响传统疫苗株的保护效力。

本研究分析了SCYA2204 S、ORF3、E、M、N基因的核苷酸同源性和遗传进化树，发现SCYA2204株与四川往年流行毒株（如CH/SCYB-1/2018、CH/SCNJ-1/2020、CH/SCXH/2018、SCDY/05/2020、SC2021）的亲缘关系密切，而与常用疫苗株AJ1102 和经典毒株CV777 的亲缘关系都较远；E基因、M基因和N基因的系统发育树均提示经典疫苗株CV777、AJ1102 与SCYA2204 的亲缘关系较远。进一步说明基于传统毒株的疫苗对于现在四川流行毒株的保护效力可能会有所下降。已有研究发现PEDV S 基因易发生重组事件，重组可能使高毒力PEDV 毒株在猪群中持续存在和传播［16-17］。本研究发现PEDV SCYA2204与25株参考毒株的S基因之间存在1个潜在重组事件，6 种重组检测方法皆呈阳性，说明PEDV 各毒株间发生重组现象的概率较高。

据调查，本次PED 发病猪场已免疫G2b亚型疫苗，但未能较好地交叉保护引发本次疫情的SCYA2204 毒株（G2b 亚型）。提示未来还需进一步筛选新型有效的PEDV 候选疫苗毒株，这对有效防控PED疫情具有重要意义。

4 结论

本研究获得了PEDV SCYA2204 株的S、ORF3、E、M 基因和N 基因的核苷酸序列，并进行了变异分析和遗传进化分析。结果得出：SCYA2204的S 基因与经典株CV777 的核苷酸同源性为93.2%，与AJ1102毒株的核苷酸同源性为96.8%，而与四川近年流行毒株的同源性高达98.1%～99.2%。这与本研究所检测的PEDV 毒株S 基因的核苷酸同源性与系统发育进化树分析结果一致。与SCYA2204 株ORF3、E、M、N 基因的核苷酸同源性最高的毒株大部分来自不同地区，仅有少数来自四川地区。PEDV 毒株分为G1和G2两个型，G1 又可以进一步分为2 个亚型，即G1a、G1b，本试验毒株SCYA2204经基因序列比对与进化树分析,被划分为G2b 亚型。和常用疫苗毒株AJ1102 相比，SCYA2204 株的S 基因具有34 个氨基酸位点变化，且发生了重组事件。