氚标记化合物在放射生物学基础与应用中的研究进展

刘芬菊

苏州大学苏州医学院放射医学与防护学院，放射医学与辐射防护国家重点实验室，苏州 215123

氚标记化合物在医学领域中被广泛应用，如3H 标记的胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine,3H-TdR）在淋巴细胞辐射效应中生物大分子损伤的早期研究[1]、H3标记的生物大分子用于研究物质在体内的代谢、扩散、交换等。此外，氚还被用于标记放射性化合物，追踪某些生物分子的行踪和代谢，以及新药的药物代谢与药物动力学的研究[2]。通过上述方法能获取药物在生物体内的代谢动力学参数，测量生物吸收利用度、器官与组织分布，计算排泄的速度与途径等数据资料，因此氚在新药研发过程中发挥着重要作用。应用氚标记方法还可以检测机体免疫功能，观察辐射后的生物效应和药物治疗后的疗效等[3-4]。

1 氚标记化合物的合成方法

1.1 氚标记化合物的化学合成法

氚标记化合物的化学合成法包括直接化学合成法和生物化学合成法。直接化学合成法是以氚气、氚水或金属氚化物为原料，通过催化还原、氚-卤取代等反应来制备氚标记化合物。其优点是可以制取定位的和近于无载体的氚标记化合物，反应副产物少，产品易于纯化；其缺点是有时化学合成步骤多，产品的化学和放射化学回收率低，难以制备多种复杂的天然产物和生物聚合物的氚标记化合物，在分子重排和同质异构现象中容易出现氚标记的转移。而生物化学合成法是以氚标记有机化合物或含氚无机化合物为作用物，利用特异酶反应和非特异反应来制备所需的氚标记化合物[5]。由于其他氚标记方法如非合成法能比较容易地获得所需的氚标记化合物，所以生物化学合成法对于制备氚标记化合物来说，不如制备其他标记化合物的应用广泛。

1.2 氚标记分子化合物

氚标记分子合成法是生物活性化合物结合和代谢特性的重要工具，特别是在药物研发过程中发挥着重要作用[6]。用T2气体直接氚化惰性C-H 键是一种理想的氚标记方法，但在标记新药化合物时，对具有不同官能团的结构复杂分子的直接氚化仍有很大的差距。特别是钯（Ⅱ）C-H 活化化学在T2气体氚化反应中的应用。与现有的氚化方法相比，这种氚化反应实际的转化显示出新的底物范围和更大的官能团耐受性，并且已被应用于直接氚化多种复杂药物和未受保护的二肽。因此分离的氚标记产物的比活性大，超过了应用于分子相互作用和代谢研究的特殊要求。氚标记的化合物合成包括以下5 类：芳烃、杂环、类固醇、手性化合物、多肽/蛋白质。上述化合物均可以通过氚标记氨基酸来实现，也可通过寡核苷酸、抗体药物共轭物及其连接物的合成等，或者通过共价键结合的方法，用氚标记生物大分子。同时，Pony 等[2]报道了一种铁催化的药物分子氚标记方法，通过该方法研发出全新的药物分子修饰技术，该修饰技术已经用于抗癌药物的研发和评估。

2 氚标记化合物的应用

2.1 氚的DNA 合成代谢作用

2.1.1 氚掺入的DNA 分子生物效应

（1） DNA 合成的原理

DNA 合成是细胞分裂的物质基础，正常DNA 的合成有2 条途径：一是主要途径，即由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成；二是辅助途径，即在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。在电离辐射作用下，DNA 合成途径受到影响。在体外实验研究中，将3H-Urd 注入到细胞培养液中，经过24 h 测量3H-TdR 掺入DNA 分子的量，从而了解其代谢产物的改变。氚标记化合物广泛应用于新药的药物代谢与药物动力学研究，其能提供药物在生物体内的物料平衡、生物吸收利用度、器官与组织分布、排泄的速度与途径等数据资料，在新药研发过程中发挥着重要作用[7-8]。

除此之外，使用3H-TdR、3H-尿氨酸（3H-Urd）、3H-亮氨酸（3H-Leu）作为培养动物细胞生物合成的前体物质，不同剂量照射后经过一定时间的培养，检测其掺入到生物大分子的每分钟放射性计数，从而得出生物大分子合成的百分率，该实验的结果表明生物大分子合成随照射剂量的增加而逐渐降低[9]。进一步DNA 掺入实验结果表明，电离辐射及异三尖杉酯碱对生物大分子的合成具有明显地抑制作用[5]。

（2） DNA 损伤与修复

电离辐射可以导致细胞DNA 分子损伤，其损伤包括DNA 链的断裂、碱基的损伤、氢键的断裂等。损伤后的DNA 在一定条件下会得到修复。苏燎原研究团队应用3HTdR 掺入方法，将外周血淋巴细胞辐照后置于 37 ℃培养箱中保温 30 min，测量发现DNA 双链断裂比例上升，说明经过保温后可重接 DNA 单链断裂，在保温 30 min 时 DNA 修复达到高峰[1,3-4,8-10]。这一研究结果表明，细胞受照后在一定条件下DNA 单链断裂可得到大部分修复。DNA 损伤修复包括光复合修复、酶的修复等。其修复程度取决于细胞辐射效应的大小，反映出不同细胞的敏感性的差异，因此不同细胞修复能力的差异会增加对辐射的耐受性。在DNA 损伤修复的实验中研究者还发现，在淋巴细胞受照射后40 min DNA 单链断裂大部分已经重接[10]。

2.1.2 氚标记化合物用于DNA 合成的测定

DNA 合成是一个生命体进化和繁殖的重要过程，是细胞分裂、遗传的物质基础。RNA 是在DNA 的模板基础上合成的，其又决定了蛋白质的合成，因此细胞内3 种大分子的合成代谢相互联系、相互制约[11]。在新药研发、职业因素、电离辐射等环境因素的作用下，均会对细胞的生长分裂产生影响。首先影响的是细胞DNA 的合成能力下降，严重者甚至导致细胞死亡。所谓DNA 合成抑制，是在DNA合成过程中受到阻滞，造成DNA 合成能力的下降。所以，一旦DNA 无法合成新的链，只能停留在G1 期，当原来的G2 期细胞分裂完成后，也不能及时合成新的DNA 分子。因此，通过氚标记化合物的检测方法可判断各种因素作用下引起的DNA 合成能力的改变。早在20 世纪60 年代初，原苏州医学院放射生物学科研人员就应用同位素标记生物大分子的实验技术研究了各种因素对细胞DNA 合成的抑制作用，如电离辐射对淋巴细胞各亚群DNA 合成的抑制，不同剂量照射后可降低细胞DNA 的合成能力等[9]。

2.2 氚标记化合物在蛋白质标记中的作用

在生命科学及生物学研究领域中，氚标记化合物是必不可少的研究工具。其不仅可以应用于酶的功能、作用机制和分析等，还可用于细胞学、分子生物学、受体结合及氚标记甘氨酸等的研究中，也可在不同时期检测放射性核素的位置及蛋白质合成的过程。通过氚标记化合物，可观察到蛋白质合成在细胞质中的完成情况，早期的研究测量氚标记的亮氨酸（3H-Leu），可以追踪蛋白分子的分布、反应和代谢过程，亦可分析得到其在核糖体中形成多肽链的量[12]，从而解释生物系统中亮氨酸的行为和功能。

氚标记化合物是用放射性核素氚取代化合物中稳定同位素氢，在蛋白质标记中，用N-琥珀酰亚胺[2-3]、3H 丙酸酯标记 IgG、过氧化氢酶和乙酰胆碱酯酶获得[13]。该方法简单、方便、易于操作，反应条件温和，可广泛用于标记蛋白质、多肽及其他含有游离氨基分子的研究中。除此之外，氚标记甘氨酸还用于蚕体蛋白质掺入实验的研究，结果显示蚕体蛋白质的氨基酸组成中甘氨酸含量较高，约占15%，这表明应用放射性同位素氚标记甘氨酸掺入法对揭示家蚕蚕体蛋白质的生理生化机制具有重要的作用。

2.3 氚标记化合物在放射生物学基础研究中的应用

氚标记化合物在放射生物学领域中应用广泛。其主要原因是由于氚标记化合物合成的成本相对较低，且更容易获得[14]，因此其可以为反应性代谢物的形成提供早期评估的重要工具，而反应性代谢物的形成被认为与特殊的药物不良反应有关，在放射生物学领域的研究中具有重要的实际应用价值。在细胞学、分子生物学、放射免疫学、药物代谢动力学、新药的筛选及肿瘤的诊断和治疗学的研究中，氚标记化合物是不可缺少的应用工具[15-16]。除此之外，3H-雌二醇-17β-葡萄糖醛酸还可用于有机阴离子转运蛋白OATP1B1 介导的转运[17]。另外，生活在相同环境中的群体，其各种疾病的发病率差异很大，说明一个人的遗传背景及对癌的易感性各异，而易感性本身又与DNA 修复有着密切的关系，DNA 及其序列的完整性在生命全过程中起着十分重要的作用，任何损伤DNA 的物质都具有潜在致癌和致基因突变的危险，无论何种原因引起的DNA 损伤，都可以通过酶系统的作用进行非顺序合成。氚标记化合物的方法可以评价DNA 和RNA 合成能力等。由此可见，DNA 修复能力高低可有效地反映个体的免疫功能，以及是否处于疾病易感状态。

Loh 等[18]研究发现，一种光氧自由基介导的氢原子转移方法，可以有效选择性利用同位素标记的水作为氢同位素的来源，将氘和氚采用一步法掺入至α-氨基sp3 碳氢键上。多种药物分子中氘和氚的高掺入，可满足配体结合分析、吸收、分布、代谢和排泄研究的要求，有益于药物的筛选。

由于氚发射的β 粒子在水介质中传播距离＜8 μm，是有限距离传播，只有结合的放射性配体足够靠近才会激活闪烁剂，而引起光发射，因此无需分离即可直接进行测量。单光子吸收法（SPA）是高通量抑制剂的筛选重要工具，并且已成功用于不同转运蛋白的功能表征的分析，如对于L-[3H]精氨酸或D-[3H]葡萄糖与固定在氟微球（包含闪烁剂）上的受体蛋白结合进行测定[19]等。

除此之外，在氚标记化合物的研究中，还可通过氢同位素交换氚标记药物的铁催化方法。将铁催化剂的位置选择性地与目前使用的铱催化剂相互交换，并且允许对药物分子中的互补位置进行同位素标记，为药物研发提供了一种新的评价工具[2]。氚标记的分子也可用于阐明生物活性化合物结合和代谢的特性，在新药的研发过程中可以发挥重要作用[20]。

3 小结与展望

早在20 世纪60 年代初，氚标记化合物的方法就用于淋巴细胞辐射生物效应及药效学的研究领域，放射性核素标记TdR 的方法常用于研究细胞及动物整体照射后细胞周期和DNA 合成能力改变的实验研究，氚标记在体外细胞、分子及蛋白质水平的研究中发挥着重要作用。临床肿瘤患者放疗前后免疫功能的恢复验证也应用氚标记技术[3-4]。随着生命科学技术的进步和生物工程的发展，氚标记核酸的制备有助于研究其在动物体内的吸收、分布、代谢以及排泄的机制，为新药的研制提供药理及药代动力学参数[21-22]。

目前，氚标记化合物3H-TdR 掺入实验已广泛用于多种生物DNA 合成能力的测定，判断生物体损伤程度及细胞的增殖能力、自然杀伤细胞（NK）活性和转化程度的变化[23-24]。根据细胞的放射性活度测出标记化合物的掺入率，该掺入方法对于研究活细胞内DNA、RNA 和蛋白质代谢的动态过程具有简便、迅速、直观、准确等优点，可以免除对DNA、RNA、蛋白质分离提纯及定量测定等复杂过程。未来氚标记化合物在医学及放射生物学领域的应用会更加广泛，亦为氚的医学防护提供重要的理论基础及实验依据。