运输密度和时间对单环刺螠保活运输品质的影响

范宏博， 胡丁月， 徐 莉， 孙 浩， 刘 峰， 刘春娥， 张小栓

（1.中国农业大学烟台研究院，山东 烟台 264670； 2.中国农业大学工学院，北京 100083）

0 引言

单环刺螠（Urechis unicinctus），俗称海肠，是一种经济类海洋无脊椎动物，分布于黄海、渤海泥沙岸潮间带及潮下带，其富含必需氨基酸、不饱和脂肪酸和微量元素，具有较高的经济价值[1-3]。

近年来，随着单环刺螠养殖产量的提升，势必对其远距离运输技术提出更高要求。鲜活的水产品更易受到消费者的青睐，然而在运输过程中，水产品极易受环境影响出现应激反应，进而导致水产动物品质降低甚至死亡。环境影响因素包括运输温度、运输密度、氧气含量和水质等。其中适宜的运输密度既可以保证运输质量又可以降低运输成本，高密度运输虽然可以提高运载量，但在运输过程中由于个体拥挤碰撞会造成机体损伤，此外动物呼吸产生的大量CO2积累，也容易引起水产生物应激反应，影响其生理状况和免疫防御功能[4-6]。TANG S 等[7]监测了鲑鱼运输过程中的CO2浓度，阐述了高密度运输引起CO2积累造成鱼的高碳酸血症。熊梅等[8]通过检测血清皮质醇水平、肌肉质构特性等指标，研究密度胁迫对草鱼的影响，发现密度胁迫对草鱼肌肉质构产生了显著影响。殷述亭等[9]通过观察大菱鲆在密度胁迫下免疫效果和应激指标的变化规律，提出5 kg/m3为最佳密度。

目前对单环刺螠保活运输的研究主要集中在运输时的水质条件、温度及保活剂的运用等方面，而对于运输密度对单环刺螠的生理应激反应的影响研究目前未见报道[10-12]。本研究分析了不同运输密度和不同时间条件下，单环刺螠生理应激差异及相关的生理指标变化，以期为缓解低温保活运输中单环刺螠的应激反应、提高产品运输品质等相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

单环刺螠，平均体长（18.2±1.5）cm，平均体质量（100±20）g，购自烟台九田水产市场；酸、葡萄糖、皮质醇、超氧化物歧化酶试剂盒，南京建成生物工程研究所；海水晶，浙江蓝海星盐制品有限公司；三氯乙酸、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、乙二胺四乙酸二钠、硫代巴比妥酸，天津致远化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

LS10T 型盐度计，衡水正旭电子科技有限公司；TGL-16A 型冷冻离心机，北京普析通用仪器有限责任公司；Synergy H1 型多功能酶标仪，BioTek Instruments,Inc；UV7 型紫外可见光分光光度计，青岛聚创环保集团有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 暂养

将单环刺螠置于透明塑料箱（84.5 cm×53 cm×51 cm）中暂养24 h。暂养条件：海水盐度3%、pH 值8、水温15 °C 左右、避光及持续充气，所用海水由海水晶和充分曝气的自来水配制成的人工海水。

1.2.2 试验分组

设置12、24、36、48 和60 h 5 个时间梯度，0 h 为对照组；每一个时间梯度下设置低密度组、中密度组和高密度组3 个密度组。具体操作：把内径为17.5 cm×7.8 cm×10.5 cm 的聚苯乙烯泡沫箱分为低密度组、中密度组和高密度组，其中低密度组为1 层，中密度组为2 层，高低密度为3 层，每层放置4～6 只单环刺螠，用硬纸板隔开。根据泡沫箱内径及单环刺螠质量计算各组密度估计值：低密度组0.5 kg/L、中密度组1.0 kg/L、高密度组1.5 kg/L，每个密度组设置3 组平行试验，所有密度组置于4 °C 冰箱中，每2 h 摇晃箱体模拟运输环境。

1.2.3 解剖取样

在相应的时间点，将单环刺螠从泡沫箱中取出，从单环刺螠背侧肛门端用解剖剪呈直线剪向吻端，将流出的体腔液收集至离心管中，在12 000 r/min 条件下冷冻离心5 min，取上清液即血清，储存于-80 °C 冰箱，待测。

1.3 检测方法

葡萄糖、乳酸、皮质醇含量及超氧化物歧化酶活力均参考南京建成生物工程研究所试剂盒说明进行测定；丙二醛含量参考GB 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》；持水力参照王硕等[13]的方法，解剖后取1 g 左右体壁，称质量，用定性滤纸包好，5 000 r/min 冷冻离心10 min 后再次称质量，并按照以下公式计算持水力。

式中m1——所取单环刺螠体壁离心前质量，g

m2——所取单环刺螠体壁离心后质量，g

1.4 数据分析

每个密度组取3 个平行，数据用“平均值±标准差”（Mean ± SD）表示，采用Excel2019 进行数据处理与作图，以运输密度和运输时间为自变量采用SPSS 21.0软件进行双因素方差分析（Two-way ANOVA），Duncan 法比较差异显著性，显著水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 运输密度和时间对单环刺螠行为的影响

在运输密度和时间的胁迫影响下，单环刺螠表现出多种特殊行为变化。胁迫12 h，3 个密度组单环刺螠体表均呈现粉红色，并且能够缓慢蠕动；36 h，3 个密度组单环刺螠应激增强，表现为身体皱缩，个别个体出现分节现象；60 h 后，单环刺螠体壁肌肉强烈收缩，体壁较硬，体表颜色变深。低密度组为深红色，而中密度组和高密度组为不同程度的黑褐色，如图1 所示。

图1 运输密度和时间对单环刺螠行为的影响Fig.1 Effect of transportation density and time on behavior of Urechis unicinctus

2.2 运输密度和时间对单环刺螠生理的影响

2.2.1 持水力

由图2 可知，初始单环刺螠持水力89%，随时间的延长，持水力整体呈下降趋势，60 h 高密度组持水力最低，为65%。所有时间段，中密度组和高密度组持水力均显著低于对照组（P<0.05），而低密度组从24 h 开始显著低于对照组（P<0.05）。不同密度对单环刺螠的持水力影响也较大，除24 h 外，其余时间点的高密度组受胁迫更为强烈，持水力均显著低于低密度组和中密度组（P<0.05）。

图2 运输密度和时间对单环刺螠持水力的影响Fig.2 Effect of transportation density and time on water holding capacity of Urechis unicinctus

持水力能直接反映肌肉抑制水分流失的能力，不仅影响肌肉色泽，还与肌原纤维蛋白的蛋白质结构和变性程度有关[14-15]。试验中在运输密度和时间的双重胁迫作用下，单环刺螠产生应激反应，体壁肌肉强烈收缩变硬，肌肉内的肌原纤维相关氢键、化学键和离子键断裂，蛋白质三维网状结构崩解，疏水基团暴露，肌原纤维蛋白的溶解性下降，蛋白与水分子的相互作用减弱，最终造成水分流失，持水力下降[16-17]。

2.2.2 抗氧化能力

由图3a 可知，超氧化物歧化酶可有效清除生物有机体内的超氧阴离子（O-2）等成分，防御氧自由基对有机体造成损伤[18]。模拟运输12 h，3 个密度组与对照组相比超氧化物歧化酶活力均未发生显著变化。36 h 后各密度组均显著高于对照组（P<0.05），除了48 h 低密度组与中密度组显著低于高密度组，36 和60 h 时间下各密度组之间没有显著差异（P>0.05），这说明长时间的运输，时间胁迫对超氧化物歧化酶活力的影响远超过密度胁迫。

图3 运输密度和时间对单环刺螠抗氧化能力的影响Fig.3 Effect of transportation density and time on concentrations of superoxide dismutase and malondialdehyde of Urechis unicinctus

丙二醛是生物膜中多不饱和脂肪酸在活性氧自由基攻击下而引发脂质过氧化的产物，被广泛用于氧化应激中自由基产生和生物膜氧化损伤程度的评价指标[19-20]。由如图3b 可知，随胁迫时间的延长，丙二醛含量呈上升趋势，48 ～60 h，低密度组、中密度组和高密度组均显著高于对照组（P<0.05）。0～36 h，3 个密度组之间无显著差异（P<0.05），说明运输时间较短时，密度胁迫对丙二醛含量的影响较小。

超氧化物歧化酶和丙二醛在免疫调节过程中发挥重要作用，可用作单环刺螠氧化应激水平的量化指标[21-22]。AHMAD I 等[23]指出，高密度养殖引起的应激反应可以增强细胞内活性氧的生成。对团头鲂的养殖试验发现，随着饲养密度的增加，丙二醛含量显著增加[24]。水产动物在应对密度和时间胁迫时，机体产生一系列氧化应激反应，产生大量自由基，诱发超氧化物歧化酶活性增强，清除过量的自由基，以降低胁迫对机体的氧化损伤。随胁迫时间的延长，超氧化物歧化酶活性被显著抑制，自由基过多引发脂质过氧化反应加剧，诱导丙二醛含量升高。因此，运输时间较短时，运输密度和时间胁迫对单环刺螠的抗氧化能力影响较小，丙二醛含量变化不显著[25]。

2.2.3 葡萄糖和乳酸含量

由图4a 可知，随胁迫时间的延长，3 个密度组单环刺螠的乳酸含量整体呈递增趋势，60 h 时高密度组达到最大值。24～60 h，3 个密度组单环刺螠的乳酸含量均显著高于对照组（P<0.05），并且高密度组呈现胁迫时间越长，乳酸含量越高的趋势，除24 h 外，其余时间点的高密度组均显著高于低密度组 （P<0.05）。

图4 运输密度和时间对单环刺螠葡萄糖和乳酸含量的影响Fig.4 Effect of transportation density and time on concentrations of lactic acid and glucose of Urechis unicinctus

由图4b 可知，除12 和24 h 低密度组，其余各时间点各密度组的葡萄糖含量均显著高于对照组（P<0.05）。运输密度胁迫对葡萄糖含量的影响也较大，12～60 h，高密度组葡萄糖含量均显著高于低密度组和中密度组（P<0.05）。

田兴[26]研究发现，运输造成斑点叉尾鮰和黄颡鱼血糖浓度显著升高。SCHRECK C B 等[27]也发现，运输胁迫会导致大麻哈鱼组织中乳酸含量的升高，与本试验结果一致。在运输过程中，低氧条件限制了机体的有氧代谢水平，机体被动进行无氧代谢，加速乳酸的产生和积累。同时，水产动物面临胁迫，体内葡萄糖被大量分解供能，一定程度上促进了肌糖原大量分解，糖异生过程加速，动物体内的葡萄糖含量升高，这一动态平衡解释了试验中葡萄糖含量的波动变化趋势[28-30]。

2.2.4皮质醇含量

由图5 可知，皮质醇含量随着胁迫时间的延长整体呈现上升趋势。前面检测的很多指标在12 h 时与对照组相比，并没有发生显著变化，然而皮质醇含量在所有时间点，低密度组、中密度组和高密度组的皮质醇含量均显著高于对照组（P<0.05）； 60 h，高密度组的皮质醇含量最高，并且显著高于低密度组和中密度组（P<0.05）。

皮质醇作为一种重要应激激素，可以有效地反映水产动物的应激程度[31]。很多研究表明，胁迫会导致血浆皮质醇含量的上升[32-35]。KLUG J J 等[36]发现，高密度养殖条件会引起虹鳟幼鱼血液中皮质醇浓度上升。在胁迫状态下，一方面，作为一种应激激素，皮质醇的分泌量会随着应激强度的增大而增加；另一方面，皮质醇含量增加，在一定程度上可以刺激糖的合成和糖原分解，引起血糖浓度升高，产生大量能量来满足自身的能量需求，这与本实验各组葡萄糖含量随时间延长而升高是一致的[37-38]。

3 结束语

无水保活运输的密度和时间不仅会影响单环刺螠的品质和口感，还会影响其免疫力、酶活力及代谢能力。运输时间过长，运输密度过大，会引起单环刺螠持续的氧化应激反应，导致单环刺螠体壁过度收缩，口感下降。同时，长时间胁迫引起的应激反应持续刺激机体产生过氧化反应，促使单环刺螠的特异性和非特异性免疫能力下降，增加对病原的敏感程度，机体抗氧化能力减弱，甚至导致死亡。因此，在单环刺螠的保活运输过程中，应根据实际情况选择合适的运输方式，较佳的无水保活运输条件：运输时间<24 h、中密度运输<1.0 kg/L，以减缓生理应激，提高单环刺螠运输质量。

图5 运输密度和时间对单环刺螠皮质醇含量的影响Fig.5 Effect of transportation density and time on concentration of cortisol of Urechis unicinctus

［1］刘峰，孙涛，纪元，等.单环刺螠生物学及生态学研究进展[J].海洋科学，2017，41（10）：125-131.LIU Feng，SUN Tao，JI Yuan，et al.Advances in studies on the biology and ecology ofUrechis unicinctus[J].Marine Sciences，2017，41（10）：125-131.