正交试验优化荆芥中总黄酮的提取工艺

谷彩花 陈卫 郝学政 信龙飞 张莉 张艳玲

基金项目：河南省科技攻关项目（222102110338）；河南省高等学校重点科研项目（24A210023，24B210014）；信阳农林学院优秀基层教学组织建设项目（YXJCJXZZ202007）；信阳农林学院农学院本科生科研训练项目（SRTP202303）。

作者简介：谷彩花（1991—），女，河南周口人，硕士，助教。研究方向：中药工艺优化与中药资源。

通信作者：张艳玲（1973—），女，河南信阳人，硕士，副教授。研究方向：中药材栽培与中药资源。E-mail：2009180048@xyafu.edu.cn。

摘 要：本文以信阳淮滨荆芥为材料，以总黄酮含量为考察指标，通过单因素和正交试验对粉碎粒度、浸泡时间、超声时间、超声温度等提取工艺条件进行了优化。结果表明，最佳提取条件为粉碎粒度80目、浸泡时间10 min、超声时间15 min、超声温度50 ℃，该条件下荆芥中总黄酮含量平均值为77.52 mg·g-1。

关键词：荆芥；总黄酮；超声波法；正交试验

Optimization of Extraction Technology of Total Flavonoids from Schizonepeta tenuifolia by Orthogonal Experiment

GU Caihua1， CHEN Wei2， HAO Xuezheng3， XIN Longfei1， ZHANG Li1， ZHANG Yanling1*

（1.School of Agricultural Sciences， Xinyang Agriculture and Forestry University， Xinyang 464000， China;

2.School of Pharmacy， Xinyang Agriculture and Forestry University， Xinyang 464000， China;

3.Henan Economic Crops Promotion Station， Zhengzhou 450000， China）

Abstract： This article uses Xinyang Huaibin Schizonepeta tenuifolia as the material and total flavonoid content as the evaluation index. The extraction process conditions， such as crushing particle size， soaking time， ultrasound time， and ultrasound temperature， were optimized through single factor and orthogonal experiments. The results showed that the optimal extraction conditions were crushing particle size of 80 mesh， soaking time of 10 minutes， ultrasonic time of 15 minutes， and ultrasonic temperature of 50 ℃. Under these conditions， the average total flavonoid content in Schizonepeta tenuifolia was 77.52 mg·g-1.

Keywords： Schizonepeta tenuifolia; total flavone; ultrasonic method; orthogonal test

荆芥（Schizonepeta tenuifolia Briq.）为唇形科植物，茎呈方柱形，上部有分枝，穗状花絮[1]，在河南、山东等地均有分布。作为一种夏季常食蔬菜，既能生食又可熟食，可用于做湯羹、面食、凉拌、馅料、调料等，气味浓郁，味道鲜美，能去除鱼虾之腥味，防暑并增强人们食欲。已有文献报道荆芥含有挥发油、黄酮类、多糖等[2]多种成分，目前针对其中的挥发油类的研究较多，但关于荆芥中黄酮类成分的报道较少，且以信阳淮滨荆芥为材料的研究尚无报道。黄酮类成分的提取方法主要有索氏提取法、水浴法、微波提取法、CO2超临界萃取法和超声提取法等，其中超声提取法最为便捷、高效。现代药理研究证明，黄酮类成分具有较强的抗炎、抗氧化、抑菌等[3-4]药理活性，但该成分受提取温度、时间、药材粒度、浸泡时间等多方面因素的影响较大。基于此，本文以信阳淮滨荆芥为材料，以总黄酮含量为考察指标，通过单因素和正交试验确定最佳提取工艺，为提高荆芥中总黄酮的含量提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荆芥采集于信阳市淮滨县，经信阳农林学院张艳玲副教授鉴定为唇形科植物荆芥的干燥地上部分，经粉碎、过筛后备用。

无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝，均为分析纯；芦丁标准品（99.51%，MUST-21011510），成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SP-1920紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；QCE20500 40 kHz超声波清洗机，上海冠特超声仪器有限公司；800A多功能粉碎机，永康市红太阳机电有限公司；FA2004电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

参照孙国艳等[5]的方法并略做修改。精确称取

5 mg芦丁标准品于50 mL容量瓶中，用少量无水乙醇使芦丁标准品溶解，再用60%乙醇溶液定容至刻度线，即为标准液。精密吸取上述标准品溶液

0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，将其分别置于10 mL容量瓶中，各加入24%乙醇使其总容积为5 mL，然后精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置5 min；精密加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；加入4%氢氧化钠溶液2 mL，加24%乙醇定容至刻度，摇匀，放置

10 min，以第一管为空白对照，于510 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），得到的芦丁标准曲线方程为Y=0.714X-0.000 7，R2=0.996 6。

1.3.2 供试品溶液制备

参照刘英翠等[6]的方法，精密称取荆芥样品粉末约1 g，共3份，置于具塞三角瓶中，分别加入60%乙醇溶液30 mL，按待考察工艺参数对荆芥中的总黄酮进行超声提取30 min，将过滤后的滤液转移至100 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，摇匀，即得供试样品溶液。

1.3.3 样品的测定

按照标准曲线的方法，精密量取试样溶液

1.0 mL于10 mL容量瓶中，取蒸馏水作为空白溶液，采用紫外分光光度计于510 nm处测定样品吸光度，代入回归曲线计算样品总黄酮含量[7]。计算公式为

（1）

式中：X总黄酮为荆芥中总黄酮含量，mg·g-1；

C为荆芥总黄酮质量浓度，mg·mL-1；V为测定样品液总体积，mL；M为荆芥干粉质量，g。

1.4 单因素试验设计

每组精密称取荆芥1 g，以总黄酮含量为评价指标[8]，以粒度65目、浸泡时间15 min、超声温度

40 ℃、超声时间20 min为基本条件，分别考察粉碎粒度（24目、50目、65目、80目和100目）、浸泡时间（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）、超声温度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃）和超声时间（5 min 、10 min、15 min、20 min和25 min）对总黄酮含量的影响。

1.5 正交试验设计

根据单因素试验结果，以粉碎粒度、浸泡时间、超声时间、超声温度为因素，采用L9（34）进行正交试验设计，因素水平设计见表1。

1.6 数据分析

使用Excel进行数据整理以及图表绘制，使用SPSS 19.0软件进行正交试验设计和数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 粉碎粒度对荆芥中总黄酮含量的影响

由图1可知，荆芥粉碎粒度在24～100目时，总黄酮含量呈先升高后下降的趋势。当粉碎粒度为

80目时，总黄酮含量达到最高，初步分析原因可能是荆芥的粉碎粒度越小，黄酮类成分在溶液中越易析出；但过100目筛后黄酮含量明显降低，这可能是荆芥粉末过细，除黄酮类外的其他化学成分和杂质也随之溶出，且在实际操作时，由于荆芥质地较轻，过筛时会有部分原料浪费。因此，选择最佳粉碎粒度为80目。

2.1.2 浸泡时间对荆芥总黄酮含量的影响

由图2可知，荆芥浸泡时间在5～25 min时，总黄酮含量的变化趋势为先升高后降低。当浸泡时间为15 min时，荆芥中的总黄酮含量达到最高，初步分析可能是浸泡可促进细胞吸水膨胀，体积增大，原料与提取液接触面积增大，内部小分子随之溶出；但浸泡时间超过15 min时，黄酮类含量呈下降趋势，可能是因为细胞壁吸水膨胀破裂，黄酮类成分被溶解的同时其他化学成分也被溶解出来，干扰黄酮类成分的测定。因此，选择最佳浸泡时间为15 min。

2.1.3 超声时间对荆芥总黄酮含量的影响

由图3可知，荆芥超声时间在10～25 min时，随着超声时间的延长，总黄酮含量呈先升高后降低再略微升高的變化趋势。当超声时间为15 min时，荆芥中总黄酮的含量达到最高点，继续延长超声时间，则黄酮含量降低。初步分析可能是超声加速了细胞内黄酮类分子的运动频率，但随着超声时间的延长，荆芥中杂质溶出、黄酮化合物分解[9]或结构受到了破坏，含量便随之降低。因此，选择最佳超声时间为15 min。

2.1.4 超声温度对荆芥总黄酮含量的影响

由图4可知，超声温度在20～60 ℃时，随着温度的升高，总黄酮含量呈先升高后降低的趋势。当温度为50 ℃时，总黄酮含量最高。初步分析可能是温度升高，分子做布朗运动的速度加快，促进了溶剂与荆芥粉末的接触，从而增加了黄酮类物质的溶出，而温度高于50 ℃时，部分对温度变化比较敏感的黄酮类物质如酚式结构类被破坏，导致提取率下降[10]。因此，选择最佳超声温度为50 ℃。

2.2 正交试验结果与分析

由表2分析可知，以荆芥中总黄酮含量为考察指标，由极差R值可知，4个因素对总黄酮含量的影响程度为粉碎粒度（A）＞超声温度（D）＞超声时间（C）＞浸泡时间（B）。分析K值得出的较优组合为A3B1C1D2，与正交表中较优组合A3B1C3D2不一致，因此进行进一步分析。由表3方差分析可知，影响超声波法提取荆芥中总黄酮的最大因素A（粉碎粒度）对应的F值为92.14，界于F0.05和F0.01之间，具有显著性，而因素B（浸泡时间）、C（超声时间）、D（超声温度）均无显著性影响，结合生产实际，超声时间越短，生产周期越短，效率越高。综合分析确定本试验的最优组合为A3B1C1D2，即粉碎粒度80 目，浸泡时间10 min，超声时间15 min，超声温度50 ℃。

2.3 最佳工艺条件的验证

称取3等份1 g荆芥样品，根据试验所得最优组合进行荆芥提取工艺验证，按照1.3项下方法进行荆芥总黄酮提取并计算含量，結果见表4。荆芥总黄酮含量的RSD为0.38%，表明试验确定的荆芥总黄酮提取工艺条件稳定，重复性较好。荆芥总黄酮含量（77.52 mg·g-1）高于正交试验表中所得结果，说明该工艺条件具有可行性。

3 结论

本文以信阳淮滨荆芥为材料，以总黄酮含量为指标，采用超声波提取法，通过单因素试验和正交试验对粉碎粒度、浸泡时间、超声时间和超声温度4个因素进行考察，得出荆芥总黄酮的最佳提取工艺为粉碎粒度80 目、浸泡时间10 min、超声时间

15 min、超声温度50 ℃，此条件下荆芥中总黄酮含量平均值为77.52 mg·g-1，明显高于文献报道[11]的数据，说明该方法高效、可行，且重现性好，具有广阔的应用前景。

参考文献

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