基于响应面法的基质固相分散萃取土壤中有机磷阻燃剂

王俊霞, 徐思婕, 孙悦莹, 雷慧慧, 程媛媛, 王学东*, 张占恩

(1. 苏州科技大学环境科学与工程学院, 江苏 苏州 215009;2. 苏州科技大学江苏省环境科学与工程重点实验室, 江苏 苏州 215009)

随着溴化阻燃剂(BFRs)在全球范围内先后被管制与禁用,有机磷阻燃剂(organophosphorus flame retardants, OPFRs)作为主要的替代品之一,被广泛添加到各种纺织品、家具以及电子产品中[1]。OPFRs具有环境持久性以及远距离运输潜力[2],导致其易于进入各种环境介质中,在水体[3]、大气[4]、灰尘[5]、沉积物[6]和土壤[7]中均已发现OPFRs的存在,尤其已在多种废物回收区[8]、电子废物回收场地周围的土壤和灰尘[9]中检测到高浓度OPFRs。大量的动物实验和流行病学研究证明OPFRs对人类与动物存在不利影响,一些OPFRs对生物体具有显著的内分泌干扰毒性和代谢毒性[10]。土壤是OPFRs的污染汇之一,准确测定土壤中OPFRs的含量,将为其环境行为和生态系统风险研究提供基础。

对于复杂固体基质样品中OPFRs的前处理往往包括提取和净化两个步骤,一般用超声辅助提取或加速溶剂萃取(ASE)[11]先进行提取,后用复合硅胶柱或Florisil柱净化[12],前处理时间约为2～5 h。为了实现土壤样品中OPFRs污染物的准确、可靠、快速定量,选择合适的样品前处理技术至关重要。基质固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion extraction, MSPD)是一种集提取、净化于一体,高效且简单的提取方法[13],已被用作灰尘样品中BFRs的提取和净化[14],通常与液相色谱(LC)[15]和气相色谱(GC)[16]联合使用。MSPD的关键在于吸附剂,常见的吸附剂有键合硅胶C18[17]、极性吸附材料Florisil[18]、极性键合相N-丙基乙二胺(PSA)[19]、多壁碳纳米管(MWCNT)[20]和石墨化炭黑(GCB)[21]等。对OPFRs选择性越高的吸附剂,方法的灵敏度越高,因此需筛选出最优吸附剂。吸附剂用量、洗脱溶剂及其体积影响MSPD萃取,因此需精心优化MSPD萃取参数,以期达到最佳的萃取效果。传统单因素分析的步骤是改变一个变量,其他参数保持不变,但这种方法缺少变量之间相互作用的信息,多个变量需要试验批次较多,试剂耗量大[22,23],因此需寻找一种试验批次较少、能反映变量之间相互作用的分析方法。

响应面法(response surface methodology, RSM)是一种基于多元非线性模型的统计技术,它不仅显示了每个因素(变量)对响应的影响,还能确定这种影响如何随着其他相关因素的变化而变化[24,25]。通过有限的试验次数在短时间内找到最佳条件。在响应面法中,中心复合试验设计(central composite design, CCD)适用于多因素、多水平、存在连续变量的试验设计,为待评估的响应提供可靠的试验,之后利用这些试验结果,建立与试验数据最拟合的数学模型,确定最佳实验条件。该文基于RSM优化MSPD的关键影响因素,并结合气相色谱-串联质谱技术(GC-MS/MS)对不同功能区土壤中10种OPFRs进行检测。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

456GC-SCION TQ气相色谱-三重四极杆质谱联用仪(德国Bruker公司); ASE-350快速溶剂萃取仪(美国Thermo Fisher公司); 12位固相萃取装置(美国Supelco公司); FD-1A-50冻干机(北京博医康); TTL-DCⅠ型氮吹仪(上海Anpel公司); IQ7000 Milli-Q超纯水系统(德国Merck公司)。

C18、PSA、Florisil、GCB和MWCNT均购自美国Sigma-Aldrich公司。乙腈、甲醇均为色谱纯,中性氧化铝和无水硫酸钠为分析纯,均购自上海梯希爱(TCI)化成工业发展有限公司,无水硫酸钠使用前,在马弗炉中450 ℃烘8 h。正己烷(n-hexane)、二氯甲烷(DCM)、丙酮(AC)和乙酸乙酯均为分析纯,均购自上海Anpel公司;血清级聚丙烯柱管(6 mL)和筛板购自深圳Biocomma生物科技公司;有机尼龙滤膜(0.22 μm)购自天津津腾实验设备有限公司。

10种有机磷阻燃剂标准品(纯度>98%)包括磷酸三丙酯(TPrP)、磷酸三异丁酯(TiBP)、磷酸三正丁酯(TBP)、磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)、磷酸三(2-氯异丙基)酯(TCIPP)、磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCPP)、磷酸三苯酯(TPHP)、2-乙基己基磷酸二苯酯(EHDPP)、三苯基氧化膦(TPPO)和磷酸三甲苯酯(TCP)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。进样内标为13C-2,2′,3,3′,4,5,5′,6,6′-九氯联苯(13C-PCB208),替代物为氘代磷酸三丁酯(D27-TBP),均购自英国剑桥同位素实验室。

准确称取10种OPFRs标准品,用乙腈配制成1 000 mg/L的混合标准溶液,于-20 ℃冰箱冷藏保存。使用时用乙腈逐级稀释至适当浓度。

1.2 样品前处理

将采集的土壤样品剔除腐烂木屑、石块等杂质,于-20 ℃冰箱中冷冻至少24 h,然后置于冻干机中冷冻干燥24 h,之后研磨,过100目不锈钢筛。精确称取0.20 g土壤样品,加入0.30 g GCB,混合均匀,室温下充分研磨5 min。将研磨后混合物装填进上下带有筛板的6 cm血清级聚丙烯柱管,装填匀实。利用10 mL乙酸乙酯缓慢洗脱,以负压抽真空方式完全收集洗脱液,之后氮吹仪浓缩至尽干,用乙腈复溶至500.0 μL,之后用0.22 μm有机尼龙滤膜过滤,将其保存在2 mL棕色进样瓶中,待进行GC-MS/MS分析。

1.3 色谱条件

色谱柱为BR-5MS毛细管色谱柱(15 m×0.25 mm×0.5 μm, Bruker,德国),高纯度氦气(纯度99.999%)作为载气,进样口温度为270 ℃,不分流模式进样,进样体积为2.0 μL;柱流量恒定为1.2 mL/min;升温程序:初始温度90 ℃保持1 min,以25 ℃/min升温至230 ℃,保持1 min,再以15 ℃/min升温至250 ℃,保持2 min。

1.4 质谱条件

离子源:电子轰击(EI)电离源,离子源和传输线温度分别为260 ℃和280 ℃,电子能量为-20 eV,碰撞压力为0.266 Pa;选择多反应监测模式(MRM),溶剂延迟时间为3 min。10种有机磷阻燃剂、内标和替代物的离子对和碰撞能量见表1。

表1 10种有机磷阻燃剂、内标和替代物的保留时间、离子对和碰撞能量

2 结果与讨论

2.1 MSPD条件考察

利用单因素法,分别考察了吸附剂种类及其用量、洗脱液种类及其体积和研磨时间对土壤中OPFRs萃取效率的影响,确定主要的、变量连续的影响因素,作为后续响应面法试验设计的变量。

2.1.1吸附剂

该文选择的10种OPFRs的极性跨度极大,既有极性的TPrP,又有非极性的TCP和EHDPP,因此选择了C18、PSA、Florisil、GCB和MWCNT 5种极性不同的吸附剂,其对土壤中OPFRs进行基质固相分散萃取的结果见图1a。C18与PSA对10种OPFRs的萃取效率较低,可能由于C18主要吸附疏水性强的非极性化合物,而PSA主要吸附极性化合物。Florisil对TPrP、TiBP、TnBP和TDCPP的萃取效率较高,但对其他OPFRs的萃取效率较低。GCB带有芳香性的正六元环结构,呈正电性,具备保留非极性化合物和极性化合物的双重作用。GCB对TPrP、TCEP以及TCIPP的萃取效率高于MWCNT,对TiBP、TBP、EHDPP和TCP萃取效率也稍高于MWCNT,但对TDCPP稍低。当GCB作为吸附剂时,收集的洗脱溶液颜色较MWCNT更无色透明(见附图1, https://www.chrom-China.com),对后续仪器分析的干扰更小。综合考虑,选择GCB作为MSPD的吸附剂。

2.1.2吸附剂用量

吸附剂用量过少会导致目标物不能被完全吸附,用量过多导致吸附较多干扰物质,增加后续净化步骤,因此需要对吸附剂用量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g)进行考察。从图1b可以看出,随着吸附剂用量的增加,各个OPFRs的萃取效率先逐渐增加,在用量达到0.3 g时,TPrP、TiBP、TBP、TCEP、TCIPP和TPPO的萃取效率均达到最大,之后各个OPFRs的萃取效率急剧下降,可能过量的吸附剂从土壤基质中吸附较多OPFRs的同时也吸附更多的干扰物质,导致洗脱困难,使得洗脱下来的目标物数量较少。吸附剂用量为0.3 g时,3种苯基OPFRs(TPHP、EHDPP和TCP)的萃取效率并不是最佳的,尤其是TPHP,其萃取效率在0.5 g时才达到最佳。在萃取效率较高的情况下,尽量选择较少的吸附剂用量,以减少对环境的影响。因此综合考虑,选择吸附剂用量为0.3 g。

2.1.3洗脱溶剂及其体积

选择洗脱溶剂的依据是“相似相溶”原理,常见的甲醇、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷等有机溶剂的极性顺序为甲醇>丙酮>乙酸乙酯>二氯甲烷。它们对土壤中10种OPFRs的萃取效率见图1c,洗脱溶剂为极性较强的甲醇和丙酮时,几乎所有OPFRs化合物的萃取效率均较低,洗脱溶剂为中等极性的二氯甲烷时,强疏水性的TDCPP、TPHP和EHDPP的萃取效率达到最大,显著高于其他洗脱溶剂。洗脱溶剂为弱极性的乙酸乙酯时,亲水性强的TPrP、TBP、TiBP、TCEP、TCIPP和TPPO的萃取效率达到最大。同时考察了乙酸乙酯与丙酮的混合溶液(1∶1, v/v),其对强亲水性OPFRs的萃取效率并未显著提高,因此选择乙酸乙酯为洗脱溶剂。

洗脱溶剂体积分别为6、8、10、12和14 mL时OPFRs的萃取效率见图1d。乙酸乙酯用量从6 mL增加到10 mL,各个OPFRs的萃取效率显著增加,在10 mL时达到最佳,继续增加洗脱体积至14 mL, OPFRs的萃取效率并未明显提高,还出现略微下降,这说明10 mL乙酸乙酯几乎完全洗脱吸附在GCB上的OPFRs,因此最终选择洗脱溶剂体积为10 mL。

2.1.4研磨时间

研磨能够增加基质与吸附剂的接触面积,从而大大增加萃取效率,研磨时间分别为1、3、5、7和9 min时OPFRs的萃取效率见图1e。研磨时间从1 min增加到5 min,所有OPFRs的萃取效率均明显提高,且在5 min时,各个OPFRs的萃取效率达到最大,进一步增加研磨时间至9 min, OPFRs的萃取效率并未继续提高反而有所下降,这可能是由于过度研磨,导致目标物与吸附剂之间吸附亲和力更强,难以将吸附的全部目标物洗脱出来,这与已有研究[26]相似。因此最终选择研磨时间为5 min。

2.2 中心复合试验设计及结果分析

2.2.1试验设计与结果分析

基于MSPD的单因子优化结果,以OPFRs化合物的平均萃取效率为响应值Y,以A(吸附剂用量)、B(洗脱剂体积)和C(研磨时间)为自变量,考察MSPD萃取条件。利用Design-Expert软件构建了OPFRs平均萃取效率与3种因素之间的模型。采用CCD进行三因素五水平响应面试验,共20组。其中14组为分析因子,6组作为区域中心点,以估计误差,因素水平编码见表2。每批次试验重复进行3次,结果取平均值。响应面试验设计与分析结果见附表1。将附表1试验结果进行回归拟合,得到一个二项式回归方程:

表2 响应面试验的因素和水平

Y=86.21-2.86A+4.54B+1.88C+1.39AB+

0.088AC+3.69BC-3.53A2-10.58B2-4.27C2

2.2.2RSM回归模型可靠性分析

为评估响应面预测结果的准确性,通过Design Expert软件对OPFRs的萃取效率回归模型进行方差分析(ANOVA),结果见表3。由表3可知,回归模型F值为176.93,且p值小于10-4,说明仅噪声引起的“模型F值”出现的可能性为0.01%,表示该模型具有显著性,同时预测模型与试验的拟合度用失拟项(lack of fit)来表示,失拟项p值为0.072 4,说明模型的纯误差不显著。模型拟合度(R2)为0.993 8,说明模型回归效果显著。

表3 回归模型方差分析

减少不显著的模型项可以提高模型拟合度[27]。预测R2=0.975 8,与调整后的R2=0.988 1,两者非常一致,R2越接近1,说明回归模型越能分析、预测MSPD对土壤中10种OPFRs的萃取条件。变异系数<10%,表明试验的可信度和精确度高。精密度(Adeq Precision)是有效信号与噪声的比值(48.457),大于4视为合理。因此,该拟合模型适用于对OPFRs萃取效率的预测。

MSPD对土壤中OPFRs平均萃取效率的模型预测值与试验值的分布图见附图2。由附图2a可知,预测值与试验值均分散于y=x附近,无异常点,表明该模型能够用来分析和预测试验值。由附图2b残差与预测值的分布图可以看出,试验残差项与模型预测值分布无序,尽可能在一条直线上,表明该模型的可靠性好。

综上分析可知,该模型能用于分析和预测基质分散固相萃取土壤中10种OPFRs的平均萃取效率。

图 2 吸附剂用量与洗脱剂体积对OPFRs平均萃取效率交互影响的响应面和等高线图Fig. 2 Surface and contour plots of influence for adsorbent dosage and eluent volume on the mean extraction recoveries of OPFRs

当P<0.05时,表示该因素是显著的模型项;P>0.05时,表示模型项不显著。从表3可以看出,在这种情况下,一次项A、B、C均达到显著水平(P<0.01),其中A、B对响应值Y的影响较大;在二次项中,A2、B2、C2(P<0.000 1)为极显著项,三者系数均为负值,说明方程存在极大值点;在交互项中,AB、BC达到显著水平(P<0.05),AC对响应值的影响不显著。综合说明各个因素对Y的影响并不是线性关系。

2.2.3单因素之间交互作用的分析

MSPD单一因素对OPFRs萃取效率的影响与单因素分析结果具有较好的一致性。各因素之间存在交互作用。其中吸附剂用量与洗脱剂体积(P<0.05)、洗脱剂体积与研磨时间(P<0.000 01)之间的交互作用更显著。

图2显示了研磨时间处于中心点5 min时,吸附剂用量和洗脱剂体积对OPFRs平均萃取回收率的交互影响。由3D响应曲面图和2D等高线响应图可以直观地看出,在同一吸附剂用量下,OPFRs平均萃取回收率随着洗脱剂体积的增加呈先上升后下降的趋势;在同一洗脱剂下,OPFRs平均萃取回收率随着吸附剂用量的增加先增加后减少。

图 3 吸附剂用量与研磨时间对OPFRs平均萃取效率交互影响的响应面和等高线图Fig. 3 Surface and contour plots of influence for adsorbent dosage and grinding time on the mean extraction recoveries of OPFRs

图 4 洗脱剂体积与研磨时间对OPFRs萃取效率交互影响的响应面和等高线图Fig. 4 Surface and contour plots of influence for eluent volume and grinding time on the mean extraction recoveries of OPFRs

图3显示了当洗脱剂体积处于中心点10 mL时,吸附剂用量和研磨时间对OPFRs萃取效率的交互作用。由图3可知,在同一吸附剂用量下,OPFRs平均萃取回收率随着研磨时间的延长先增加后减少;在同一研磨时间下,OPFRs平均萃取回收率随着吸附剂用量的增加先升高后下降。但二者交互作用相对较弱(P>0.05),这可能是因为即使增加了吸附剂的用量,仍需要一定的研磨时间使吸附剂与土壤中OPFRs充分接触,以获得良好的吸附效果,从而提高OPFRs萃取效率。吸附剂用量处于中心点0.3 mg时,洗脱剂体积和研磨时间对响应值Y的交互影响较为显著。由图4可知,当洗脱体积一定时,OPFRs平均萃取回收率随着研磨时间的增加呈现先增大后减小的变化趋势,研磨时间为5 min时,OPFRs萃取回收率最大,当研磨时间一定时,OPFRs萃取回收率随着洗脱剂体积增加呈先升高后下降的变化特征。

综合分析发现,不同MSPD萃取条件位于中心点时,MSPD技术提取土壤中OPFRs效率最高。根据预测模型得到最优结果:0.3 g吸附剂、10 mL洗脱剂和5 min研磨时间,此时模型预测MSPD对土壤中OPFRs的平均萃取回收率达到87.5%。

2.3 方法学考察

2.3.1线性关系、检出限与定量限

利用10 mg/L的10种OPFRs混合标准溶液配制成质量浓度分别为1.0、10.0、50.0、100.0、500.0、1 000.0 μg/L的系列标准工作溶液,以10 ng13C-PCB208为内标化合物,以标准工作溶液中OPFRs的质量浓度(x, μg/L)为横坐标,OPFRs的峰面积与内标峰面积之比(y)为纵坐标,建立10种OPFRs的标准工作曲线。如表4所示,10种OPFRs在1.0～1 000.0 μg/L范围内具有良好的线性关系,相关系数(r)≥0.998 2。土壤质量固定为0.2 g,以适量低浓度OPFRs加标土壤样品进行MSPD处理,分析OPFRs的峰面积响应信号,分别以3倍和10倍信噪比(S/N)确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。同时用空白程序验证实验过程试剂、容器等是否污染。由于TBP、TiBP和TPrP常作为增塑剂,实验过程中使用的过滤膜、吸管等可能含有这些OPFRs,导致空白程序中有少量的TBP、TiBP和TPrP检出,这3种化合物的检出限以空白均值加3倍标准偏差来计算。结果见表4。10种OPFRs的LOD和LOQ分别为0.006～0.161 ng/g和0.020～0.531 ng/g。

表4 10种OPFRs的线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.3.2回收率与精密度

以空白加标、基质加标回收率试验来考察MSPD提取土壤中OPFRs方法的性能。具体以无水硫酸钠替代土壤基质作为空白样品,向空白样品和4种实际土壤中分别添加3个水平的OPFRs混合标准溶液,使土壤中OPFRs含量分别为10、20和100 ng/g,并混合均匀静置7 d。同时MSPD过程开始前,在空白样品和实际土壤样品中添加20 ng/g的替代物D27-TBP,以替代物回收率来验证MSPD方法对每个样品的提取效率。空白、实际土壤中10种OPFRs和替代物的加标回收率及相对标准偏差(RSD,n=3)见表5。10种OPFRs的平均回收率为70.4%～115.4%, RSD为0.7%～6.7%,实际土壤中替代物D27-TBP的平均回收率为88.2%～95.6%。方法满足测试要求。

表5 10种OPFRs和替代物在3个水平下的加标回收率及RSD(n=3)

表5 (续)

2.3.3MSPD与ASE对比

为了验证该方法的准确性,与传统的加速溶剂萃取法进行比较。同样准确称取0.2 g加标农田土壤样品(OPFRs含量为100 ng/g),以乙酸乙酯为萃取剂,萃取温度为110 ℃,压力为104kPa,循环4次,每次5 min,萃取收集液氮吹至尽干,后续与MSPD步骤相同。结果见附表2,MSPD萃取土壤中10种OPFRs的效率与ASE方法的结果基本一致,但MSPD具有操作简单、前处理耗时短和有机溶剂用量少等优点。

图 5 空白和实际土壤样品中10种OPFRs的色谱图Fig. 5 Chromatograms of the 10 OPFRs in the blank and actual soil samples a. blank; b. electronics factory; c. auto-repair factory; d. paddy field; e. school field. Peak identifications: 1. TPrP; 2. TiBP; 3. TBP; 4. TCEP; 5. TCIPP; 6. TDCPP; 7. TPHP; 8. EHDPP; 9. TPPO; 10. TCP; 11. 13C-PCB208; 12. D27-TBP.

2.4 实际样品检测

利用该方法分析了苏州市不同地区(某电子厂、某汽修厂、某稻田、某校园)土壤中10种OPFRs,含量范围见表6。空白和各个实际土壤样品中10种OPFRs的色谱图见图5。在4个实际土壤样品中发现10种OPFRs的总含量范围为6.49～26.00 ng/g。电子厂和汽修厂土壤中OPFRs含量显著高于农田和校园,说明电子厂和汽修厂存在较高的OPFRs污染来源,工厂土壤中主要污染物为TCIPP、TPPO、TCEP和TDCPP,它们在电子厂土壤中含量分别为5.30、4.44、4.54、4.20 ng/g,在汽修厂土壤中含量分别2.70、3.93、7.60、5.04 ng/g。TPPO主要用于合成中间体、催化剂和萃取剂等,目前关于土壤中TPPO污染的报道较少,仅有辽河上游河岸带土壤中发现TPPO为主要污染物的报道[28],而农田土中主要污染物为TPrP、TDCIP和TiBP。这与已报道的北京地区农田土以TCIPP((3.36±5.61) ng/g)为主的结论并不一致[29]。校园土中主要污染物以TCIPP和TPrP为主。苏州地区土壤中OPFRs检出含量远低于尼泊尔市(25～27 900 ng/g)[30]。总体上目前苏州地区土壤中OPFRs污染水平较低。

表6 不同采样点土壤中10种有机磷阻燃剂的含量

3 结论

本文建立了一种MSPD-GC-MS/MS检测土壤中10种OPFRs的方法。单因素分析法结合RSM系统地分析了基质固相分散萃取土壤中OPFRs回收率的关键影响因素以及因素之间的相互作用,建立了OPFRs萃取回收率为响应值的回归模型,模型预测值与试验值具有良好的拟合度,确定了最优的萃取条件。该方法涉及实验少、有机溶剂用量少、操作步骤简单便捷,且具有良好的准确度和精密度。将该方法应用于不同功能区土壤中OPFRs残留量的监测分析,发现了电子厂和汽修厂土壤中高水平TPPO污染,后续有必要开展这类污染物的生态环境风险评估。