环糊精类聚阳离子纳米载体材料的合成及其自组装性能研究——介绍一个生物医学材料课程的综合设计实验

＊杨 斌

（广州医科大学生物医学工程学院 广东 511436）

纳米载体技术的发展革新了现代医学的诊断和治疗，为多种疾病的治疗提供了高新技术手段。利用不同纳米材料并合理选择制备方法可以获得具有各种尺寸、形状和表面性质的载体，通过考察相关性质对纳米制剂生物学效应的影响，可以得到针对不同种类细胞进行递送的纳米载体系统。进一步筛选合适的分子作用靶点，能够利用特定的纳米制剂调控相应的功能，最终实现对疾病的靶向治疗[1-3]。作为功能性纳米载体的一种，刺激响应型（stimuli-responsive）聚合物在药物控制释放、基因载体及纳米反应器等诸多领域有着广阔的应用前景[4-5]。聚阳离子纳米材料能够通过静电作用负载DNA等负电性治疗剂，同时可以实现对药物的包封和可控释放，是一类理想的纳米载体系统。本实验源于生物医用高分子领域的前沿研究成果，应用于我校生物医学工程专业的生物医学材料综合实验课程教学，面向大三年级本科生开设。通过本教学实验的开展，期望学生能够在指定的实验方向下自主设计实验内容和详细步骤，在不同实验分组完成后比较实验结果并进行分析，最终得出结论。在该课程中综合了本专业相关基础实验的内容与操作，同时将设计性融入到实验过程中，有利于培养学生的创新精神。由于该实验相对比较复杂，需要学生前期掌握有机化学、高分子化学、生物材料的合成与制备技术、生物材料的表征技术等相关理论和实验课程，而这些课程已经在本专业前期教学中均有所涉及，从而为本实验的顺利开展奠定了良好的基础。

1.实验目的

（1）掌握聚阳离子纳米载体材料构建的基本原理和方法。

（2）掌握纳米载体材料的常用表征手段。

（3）熟悉自组装的原理和方法。

（4）了解主客体化合物的基本性质。

2.实验原理

环糊精是由葡萄糖单元经（1→4）糖苷键相连形成的环状低聚物，根据单糖个数的不同（6、7、8个）分别命名为α-、β-、γ-环糊精。环糊精本身具有两亲性结构，内腔疏水，外侧亲水，这使得其能在水中溶解，毒性很低且无免疫原性。作为主体分子，环糊精能够与多种小分子客体通过超分子作用力进行组装，从而引入不同的功能。最为典型的是，β-环糊精（Cyclodextrin，CD）与金刚烷（Adamantane，AD）能够通过主客体作用形成类似“锁钥”关系的分子间专一性结合。因此，借助环糊精和金刚烷的主客体自组装构建聚阳离子材料不会涉及复杂的化学反应，易于实现材料的功能化修饰，通过后期组装制备具有纳米尺度的载体，具有广泛的应用前景[6-7]。

本实验通过模板-模块的形式将功能性客体分子组装到低分子量的阳离子载体体系中[8-9]，即以氨基修饰的环糊精作为模板分子（主体部分）有效负载DNA，同时功能化的金刚烷衍生物作为模块（客体部分）可以介导特定的功能，二者自组装得到聚阳离子纳米载体材料（如图1所示）。进一步借助实验室现有的仪器设备和条件，通过核磁共振氢谱、扫描电子显微镜、凝胶电泳仪等探究载体材料的结构正确性和功能有效性，以期用于基因和药物的有效负载，最终实现治疗的目的。

图1 聚阳离子纳米载体材料的合成路线示意图（A）主体化合物CD-TAEA的合成；（B）客体分子PB-AD的合成及其主客体组装纳米载体的结构

3.仪器和试剂

仪器：磁力搅拌器，涡旋震荡器，水浴锅，pH计，冷冻干燥机，核磁共振波谱仪，扫描电子显微镜，凝胶电泳仪。

试剂：N,N-二甲基甲酰胺（DMF），二甲亚砜（DMSO），三乙胺（TEA），3-氨基苯硼酸（PB-NH2），N,N'-羰基二咪唑（CDI），β-环糊精（CD），1-金刚烷酰氯（ADC），三(2-氨基乙基)胺（TAEA），D2O，氢氧化钠，盐酸，琼脂糖，编码荧光素酶的质粒pGL-3，GelRedTM染料。

4.实验内容

（1）β-环糊精-三(2-氨基乙基)胺（CD-TAEA）的合成。将CD（1.0g，0.9mmol）溶解在10mL DMF中，然后将事先溶解在10mL DMF中的CDI（2.0g，12.3mmol）溶液逐滴加入到上述溶液中，室温下搅拌2h进行活化，然后倒入无水乙醚中沉淀，离心后收集沉淀物并重新溶解在15mL DMSO中。将1mL三乙胺加入该DMSO混合液后滴加至事先溶解在5mL DMSO的TAEA溶液中，室温下搅拌反应24h。反应混合液经透析（MWCO：3500）后冷冻干燥得产品CD-TAEA。

（2）金刚烷修饰的苯硼酸（PB-AD）的合成。将PB-NH2（0.6g，4.4mmol）与ADC（0.6g，3.0mmol）溶解在20mL DMF中，加入三乙胺1.2mL，0℃下搅拌反应24h。将DMF溶剂减压蒸出，过量的ADC及反应生成的三乙胺盐酸盐用蒸馏水多次洗涤除去，然后在50℃下真空干燥得到浅黄色产品PB-AD。

（3）核磁氢谱（1H NMR）表征。分别取CD-TAEA和PB-AD固体，在氘代试剂中溶解后制备样品，使用核磁共振波谱仪检测。纳米组装体的结构通过1H-1H COSY二维谱来表征其相互作用。

（4）纳米组装体的构建。将PB-AD与CD-TAEA一起溶解在10mL DMF中，在50℃下剧烈搅拌1h。然后将5mL蒸馏水通过注射器在2h内缓慢加入到上述溶液中，50℃下继续搅拌过夜，将组装体溶液对水透析（MWCO：3500），过滤后冻干得到超分子自组装体PBAD/CD-TAEA。

（5）凝胶电泳。将不同N/P比的载体材料与0.1μg DNA的复合物加入含有2μL GelRedTM染料的0.7%(w/v)的琼脂糖凝胶中，电泳实验在80V电压下TAE缓冲溶液中进行，1h后在凝胶成像仪下通过紫外照射成像来观察。

（6）缓冲能力的测定。载体材料的缓冲能力通过酸碱滴定的方法测定。分别称取6mg的载体材料溶解于30mL的超纯水中，将该溶液先用0.1M的NaOH调节pH到10，然后用0.1M的HCl溶液进行滴定使其pH达到2.5，以pH值的变化对所加HCl溶液的体积作图。在这里将缓冲能力定义为pH在7.4到5.1的范围内能够被质子化的氨基所占的百分含量，计算公式如下：PA=(ΔVHCl×0.1M)/Nmol×100%。其中ΔVHCl是将溶液的pH范围从7.4滴定到5.1所需要的HCl溶液的体积；Nmol为6mg载体材料中能够被质子化的氨基总的摩尔数。

（7）扫描电镜观测形貌。载体材料与DNA的复合物形貌通过扫描电镜来观察。将三种材料在最佳N/P比时的复合物样品进行减压喷金处理，在放大500倍的情况下对组装体复合物的形貌进行观察。

5.结果与讨论

（1）聚阳离子纳米载体的合成与结构表征。本实验以氨基功能化的环糊精与金刚烷修饰的苯硼酸通过主客体作用构建了一种超分子组装体。首先，带有多个氨基的TAEA小分子与经CDI活化的环糊精反应制备主体分子，然后通过3-氨基苯硼酸与1-金刚烷酰氯的酰胺化反应合成苯硼酸连接的金刚烷作为客体分子。通过1H NMR来表征相关分子的化学结构，CD与TAEA所有基团的特征峰都有相应的归属，通过积分面积计算可以得出每个CD分子上连接TAEA分子的数目。PB-AD的合成在ADC过量的前提下通过酰胺化反应完成，其中PB与AD基团的特征峰都有相应的归属。通过主客体组装成功构建了超分子体系，以1H-1H COSY二维谱（图2）来证实组装体的形成，可以看到CD与AD基团的相关质子具有偶合关系，相关峰的信号呈对称状出现在二维谱图中，从而证实了自组装过程的发生。

图2 PB-AD/CD-TAEA组装体在D2O溶液中的1H-1H COSY图谱

（2）聚阳离子纳米载体的性能测试。通过琼脂糖凝胶电泳实验评估CD-TAEA及PB-AD/CD-TAEA结合质粒DNA的能力，在不同的N/P比下考察氨基密度变化和聚阳离子纳米载体复合能力的关系。通过酸碱滴定的方法测定CD-TAEA及PB-AD/CD-TAEA的缓冲能力，以生理盐水为阴性对照，金标准PEI25K为阳性对照。一般而言，聚阳离子的电荷密度越高，其复合DNA的能力越强，缓冲能力也越高，通过不同分组间聚阳离子电荷密度的差异来验证上述结论。最后通过扫描电镜（SEM）观察载体与DNA在最佳N/P比下所形成复合物的形貌，可以发现复合物分布均匀且呈规则的球形，粒子大小均在100nm以下。

6.实验教学组织形式

本实验专为我校生物医学工程专业生物医学材料综合实验课程开设，面向大三年级本科生，目前已经完成2届学生的教学。在学生课前进行文献调研的基础上，以小分子化合物三(2-氨基乙基)胺与环糊精的的投料比不同进行分组，每组4～5人，在完成所有实验后进行组间对比，通过讨论分析实验结果，最终形成完整的实验报告。整个综合实验课程分3个阶段完成：（1）理论讲述相关实验背景和主要实验原理和内容（1学时），分别完成主客体化合物的合成（7学时）；（2）表征合成产物的结构，研究主客体自组装行为（4学时）；（3）通过相关表征手段研究聚阳离子纳米载体的理化性质并分析实验结果（8学时）。

7.结语

本实验结合纳米技术与生物材料研究中的热点，通过主客体化学构建不同电荷密度的聚阳离子纳米载体，并通过多种手段表征其理化性质，综合了本专业相关基础实验的内容与操作，同时将设计性融入到实验过程中，有利于培养学生的创新精神。在教学过程中，将思政教育与生物医学材料的教学元素有机融合，重点发掘知识体系中自带的科学理性价值观，可以有效激发学生的兴趣，引导学生树立正确的人生观和价值观。